1. 引言
糖尿病主要分为I型糖尿病和II型糖尿病。I型糖尿病为胰岛β-细胞损伤而导致胰岛素分泌缺乏,II 型糖尿病主要是胰岛素分泌减少;组织对葡萄糖摄取和利用的能力降低;胰岛素作用降低,包括胰岛素抵抗性、胰岛素敏感性的下降。现代人因为精致饮食,过量摄取高糖份或是高脂肪饮食且运动量不足,增加糖尿病的发生率,糖尿病为慢性代谢疾病,其并发症会影响眼睛、肾脏、神经、血管等方面的病变 [1] ,因此预防及延缓其进展是相当重要的。
益生菌具有可以改善肠躁症、抗发炎、改善异位性皮肤炎和抗过敏等功能 [2] ,近期研究显示,益生菌对于降低血糖也具有一定效果。根据文献,鼠李糖乳酸杆菌及干酪乳杆菌,具有改善葡萄糖耐受不良的功效 [3] [4] 。据Yadav等人研究指出,干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌发酵之酸奶对于高果糖饮食诱导之糖尿病大鼠,可以降低其血糖 [5] 。此外,加氏乳杆菌和植物乳杆菌也具有降低血糖之效果 [6] [7] 。
本研究以植物乳杆菌(L. plantarum GKM3)、肠膜明串珠菌(L. mesenteroides GKM5)及副干酪乳杆菌 (L. paracasei GKS6)喂食C57BL/6JNarl小鼠14天后,以口服葡萄糖耐受性试验(OGTT)方式,进行喂食高浓度葡萄糖溶液,评估调节血糖能力测试,依结果显示挑出改善葡萄糖敏感性之效果最佳菌株。再以长期高脂饮食模式诱导Wistar大鼠使其产生高血糖症模式,进一步分析其降血糖效果。
2. 材料與方法
2.1. 调节血糖能力测试
2.1.1. 益生菌冻干粉末制备
GKM3、GKM5及GKS6培养于5 L MRS培养基中,经37℃、16小时培养后,以8000 rpm、20℃、离心30分钟去除上清液,取得菌体,混入含20%脱脂奶粉液后,冷冻真空干燥而得。保存于−20℃备用,试验时取出调整菌数为5 × 109 CFU/g供喂饲。
2.1.2. 试验动物与饲养
四十只雄性C57BL/6JNarl小鼠购自国家实验研究院实验动物中心(台湾,台北)。经过一周的观察期,将小鼠随机分组;共分四组,包括水对照组及三实验组,每组10只,分成两盒,各饲养5只。三实验组之益生菌剂量皆为500 mg/kg mouse。灌食体积为0.1 mL/10-gbody weight/day;灌食十四日。采美国NEPCO公司(Warrensburg, NY, USA)实验动物专用木屑垫料Aspen and Shredded Aspen Shavings,经灭菌后使用,每周更换2次。按一般(conventional)实验动物饲养管理方法进行:动物饲养室之环境设定为(23 ± 2)℃的温度、(50 ± 10)%的相对湿度、12小时光照/黑暗交替。
2.1.3. 口服葡萄糖耐受性测试(Oral Glucose Tolerance Test, OGTT)
使C57BL/6JNarl小鼠禁食16小时,先自尾端采集血液样本,以Glucosure II血糖机(ApexBio., Taiwan)搭配血糖测试片(葡萄糖氧化酵素法) 检测空腹(0分钟)血糖值。再管喂葡萄糖溶液(2 g/kg)。之后在30、60及120分钟时检测血糖浓度。
2.1.4. 摄食量、饮水量以及脏器重量
喂食期间,每周量测体重一次、饲料摄取量及饮水量各两次。于OGTT之后牺牲小鼠,取肝、肾、脾脏,秤重。
2.1.5. 统计分析
实验结果以Mean ± SEM表示,以Student’s t-test进行各实验组与水对照组间之比较。
2.2. 以高脂饮食诱导血糖代谢异常
2.2.1. 试验动物与饲养
本次试验使用SPF级Wistar雄性大鼠12只进行试验,大鼠体重介于201~225 g,经一周适应环境后进行六周的实验饲养,饲养温度控制为22℃ ± 2℃,相对湿度为60%~80%,12小时之光暗周期(07:00~19:00为光照期;19:00~07:00为黑暗期)。
2.2.2. 试验设计
12只试验动物喂予正常成鼠饲料和饮用蒸馏水适应环境1周后,将其随机分为三组,每组四只。其分组如下:正常组(normal diet, ND)、高脂饮食组(high-fat diet, HFD) (饲料配方:以AIN93G为基础额外添加油脂,比例如下:饲料固形物68%、大豆油7%和猪油25%)及HFD + GKS6组[高脂饮食组合并管喂副干酪乳杆菌GKS6益生菌冻干粉末(其活菌数5 × 109 cfu/g,试验动物剂量为102.8 mg/kg rat/day),并溶于100 μL磷酸盐缓冲溶液管喂食]。试验期间,试验动物自由摄食饲料及饮水。每日纪录大白鼠之食物摄取量(food intake)、饮水量(water intake)和食物利用率(feed efficiency)。试验开始先纪录试验动物之起始体重(initial body weight),随后每两日秤量体重并观察体重变化。给予试验样品之时间共6周,并于试验结束前12小时进行禁食。使用CO2进行牺牲,并纪录其最终体重(final body weight)和体重改变量(weight change)。从大鼠静脉进行血液采集,并作为后续血清生化分析。同时,取出脏器组织(心脏、肺脏、肝脏、脾脏和肾脏)利用生理食盐水清洗并擦拭干净,纪录各个脏器的重量,以铝箔纸包覆,使用液态氮冷冻后保存于−80℃冰箱,以供后续试验分析使用。试验动物之食物利用率(%)及体重改变量(g)之计算公式如下
2.2.3. 血清生化参数测定
将试验动物以二氧化碳牺牲后,血液收集于血清分离管(BD Vacutainer, Plymouth, UK)中,以4000 g离心10分钟将血清取出,分装于微量离心管中,并储存于−80℃冰箱,作为后续分析使用。血清三酸甘油酯、葡萄糖、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、天门冬胺酸转胺酶、丙胺酸转胺酶、尿酸、肌酸酐、钠离子、钾离子与氯离子浓度以市售分析套组(Diasys Co. Ltd., Holzheim, Germany)进行检测。酮体以市售分析套组(Denka Seiken Co. Ltd., Taipei City, Taiwan)进行检测。
2.2.4. 统计分析
实验数据使用SPSS计算机统计软件进行分析。变异数分析则以PROC ANOVA与Duncan’s multiple range test进行分析,p < 0.05为具有显著性差异。
3. 结果
3.1. 调节血糖能力测试結果
3.1.1. 益生菌对C57BL/6JNarl小鼠体重、食物摄取量、饮水量之影响
管喂十四天后,GKS6组之体重及体增重(克数及百分比)均显著低于水对照组(p < 0.05) (表1)。在此期间,GKS6组之饮水量也明显较水对照组为低(p < 0.01),但其饲料摄取量则与水对照组之间无统计上的显著差异性(p = 0.24) (表2)。
Table 1. Effect of probiotics on body weights of C57BL/6JNar mice during the trial
表1. 试验期间益生菌对C57BL/6JNar小鼠体重之影响
结果以mean ± SD表示(n = 10)。*及**分别表示与水对照组之间p < 0.05、p < 0.01。
Table 2. Effect of probiotics on food intake and water intake in C57BL/6JNar mice during the trial
表2. 试验期间益生菌对C57BL/6JNarl小鼠平均每日摄食量及饮水量之影响
结果以mean ± SD表示(n = 10)。**表示与水对照组之间p < 0.01。
3.1.2. 益生菌对C57BL/6JNarl小鼠脏器重量之影响
管喂十四天后,GKM3组及GKM5组之肝脏、肾脏及脾脏重量均与水对照组之间无统计上的差异性,与前述体重及体增重的变化趋势相同,GKS6组之肾脏重量显著较水对照组者为低,但其相对重量比则与水对照组没有差异(表3)。
Table 3. Effect of GKM3, GKM5 and GKS6 on the weights of organs in C57BL/6JNarl mice
表3. GKM3、GKM5、GKS6对C57BL/6JNarl小鼠脏器重量影响
结果以mean ± SD表示(n = 10)。**表示与水对照组之间p < 0.01。
3.1.3. 益生菌对C57BL/6JNarl小鼠于口服葡萄糖后其血糖变化影响
在口服葡萄糖耐受性试验,GKM3及GKS6二实验组的30分钟血糖值(blood glucose)均显著地较水对照组为低(表4)。GKS6组的120分钟血糖曲线下面积(area under curve, AUC120 min)亦略低于水对照组(p < 0.05)。若以血糖上升值(blood glucose increments)来看,则三实验组的30分钟血糖上升值(i30 min)以及120分钟血糖上升曲线下面积(iAUC120 min)都明显的低于水对照组(表4)。GKM5及GKS6二组的120分钟血糖上升值(i120 min)也显著较水对照组者为低。综合上述,以GKS6最具降血糖潜力,故选GKS6继续进行大鼠试验。
Table 4. Changes of oral glucose tolerance in C57BL/6JNarl mice in each groups after 14 days
表4. 管喂14天后,各组C57BL/6JNarl小鼠于口服葡萄糖耐受性试验之血糖变化
在管喂十四天水或试验物后,使小鼠禁食16小时,以剪尾方式采血,先以血糖试片测试0 min (禁食)血糖,继而管喂2 g/kg B.W.之葡萄糖溶液,以进行葡萄糖耐受性测试。结果以mean ± SEM表示(n = 10)。*及**分别表示与水对照组之间p < 0.05、p < 0.01。
3.2. 高脂饮食诱导高血糖
3.2.1. GKS6对高脂饮食诱导高血糖大鼠之体重、食物摄取量、能量摄取、饮水量与食物利用率之影响
表5为副干酪乳杆菌GKS6对高脂饮食诱导高血糖大鼠之体重、食物摄取量、食物利用率、饮水量与能量摄取之影响。由结果得知,在试验初始时,各组之间体重上并无显著之差异(p > 0.05)。高脂饮食之组别于试验结束时其体重显著高于正常饮食组(p < 0.05),HFD合并给予副干酪乳杆菌GKS6组别,可显著降低因高脂饮食所带来的体重增加现象(p < 0.05)。在体重改变量和食物利用率上结果亦同。高脂饮食合并GKS6组与单纯高脂饮食组别相比,并不会影响食物摄取和能量摄取(p > 0.05)。单纯给予高脂饮食组别之大鼠,在食物利用率上显著高于正常饮食组(p < 0.05)。而在高脂饮食给予益生菌冻干粉末之组别可较高脂饮食组显著降低食物利用率(p < 0.05)。
Table 5. Effect of Lactobacillus paracasei GKS6 on body weights, food intake, energy intake, water intake, and feed efficiency in high-fat diet-induced hyperglycemia rats
表5. 副干酪乳杆菌GKS6粉末对高脂饮食诱导高血糖大鼠之体重、食物摄取、能量摄取、饮水量与食物利用率之影响
The reported values are the mean ± SEM (n = 4). Mean values with different letters were significantly different (p < 0.05).
3.2.2. GKS6对高脂饮食诱导高血糖大鼠之脏器重量之影响
表6为本次实验中对高脂饮食诱导肥胖大鼠之脏器重量影响。各试验组大鼠以二氧化碳牺牲后,取下其脏器包含心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏,并分别纪录其重量。由结果得知,在肝脏重量上,高脂 + GKS6组相较于单纯给予高脂饮食组,可显著降低高脂饮食所诱导肝脏重量之增加(p < 0.05)。心脏、脾脏、肺脏和肾脏重量上,各试验组大鼠均无显著之差异(p > 0.05)。
Table 6. Effect of Lactobacillus paracasei GKS6 on the weights of organs in high-fat diet-induced hyperglycemia rats
表6. 副干酪乳杆菌GKS6对高脂饮食诱导高血糖大鼠之脏器重量之影响
The reported values are the mean ± SEM (n = 4). Mean values with different letters were significantly different (p < 0.05).
3.2.3. GKS6对高脂饮食诱导高血糖之血清生化参数之影响
表7为本次实验各大鼠之血清生化分析结果;试验动物饲养6周后以二氧化碳牺牲,并从静脉进行血液收集,作为后续血清生化分析。在血糖方面,高脂组其血清中血糖值显著高于正常组,给予益生菌冻干粉末之高脂 + GKS6组中,可见显著降低高脂饮食引起血清中血糖之浓度升高情形(p < 0.05)。在血脂质相关结果显示,高脂饮食组大鼠其血清中三酸甘油酯值显著高于正常饮食组(p < 0.05)。在高脂饮食诱导之高血糖大鼠,给予益生菌冻干粉末之高脂 + GKS6组中,可见显著降低高脂饮食引起血清中三酸甘油酯之浓度升高情形(p < 0.05)。另外,正常饮食组别之大鼠其血清中总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量与钾离子浓度,皆显著高于高脂饮食组(p < 0.05)。在天门冬胺酸转胺酶、丙胺酸转胺酶、肌酸酐、钠离子和氯离子之浓度上,各组之间均无统计之显著差异(p > 0.05)。此外,高脂饮食组别之大鼠其血清中尿酸与酮体显著高于正常饮食组别(p < 0.05)。在高脂饮食诱导之肥胖大鼠,给予益生菌冻干粉末之组别,可显著降低高脂饮食所诱导之血清酮体和尿酸浓度之升高(p < 0.05)。
Table 7. Effect of Lactobacillus paracasei GKS6 on the serum biochemical parameters in high-fat diet-induced hyperglycemia rats
表7. 副干酪乳杆菌GKS6粉末对高脂饮食诱导肥胖大鼠之血清生化参数之影响
The reported values are the mean ± SEM (n = 4). Mean values with different letters were significantly different (p < 0.05).
4. 讨论
在调节血糖能力测试部分,管喂十四天后,再口服葡萄糖耐受性试验,GKM3及GKS6二实验组的30分钟血糖值(blood glucose)均显著地较水对照组为低(表4)。GKS6组的120分钟血糖曲线下面积(area under curve, AUC120min)亦略低于水对照组(p < 0.05)。若以血糖上升值(blood glucose increments)来看,则三实验组的30分钟血糖上升值(i30 min)以及120分钟血糖上升曲线下面积(iAUC120min)都明显的低于水对照组(表4)。GKM5及GKS6二组的120分钟血糖上升值(i120 min)也显著较水对照组者为低。无论是120分钟血糖曲线下面积或是120分钟血糖上升曲线下面积,GKS6组别皆较GKM3组及GKM5组为低,因此选择GKS6进行长期高脂饮食诱导血糖代谢异常大鼠试验,验证其降血糖效果。
目前常用以评估血糖代谢异常之动物实验模式,为使用链脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)腹腔注射诱导的糖尿病动物模型。STZ对胰岛β细胞有选择性破坏作用,能诱导产生糖尿病。普遍选用雄性大鼠来制备糖尿病模型 [8] [9] ,这种模式较符合第一型糖尿病之机制。先前研究显示长时间摄取高油脂饮食会造成血脂、血糖代谢异常 [10] [11] 。因此利用高脂饮食诱导大鼠产生轻微之血糖代谢异常,进而诱导类第二型糖尿病,较适合做为开发保健食品之实验模式。本实验在高脂饮食下给予GKS6株,在不影响试验动物食物摄取量与能量摄取量之下(p > 0.05),可以显著降低由高脂饮食所诱导之体重增加之情形(p < 0.05) (表5),喂食大鼠高脂饮食组的结果与喂食一般饲料相比,高脂饮食组别比一般饲料组促使血糖浓度上升,增加血液中三酸甘油酯浓度(表7),显示高脂饮食确实会诱发大鼠体内血糖及血脂代谢异常。本研究显示喂食高脂饮食下同时喂食GKS6,能降低喂食大鼠高脂饮食所诱发之血糖、血液三酸甘油酯增加。另外在大鼠血清之安全性指标(血脂、肝损伤指标、肾功能指标和电解质浓度)则未见有任何负面影响,可得知GKS6是一安全之降血糖补充剂。
5. 结论
在口服葡萄糖耐性测试中,GKS6能显著减少血液中葡萄糖浓度之上升。利用长期高脂饮食诱导大鼠产生轻微之血糖代谢异常状态下,GKS6具有降低空腹血糖值之效果,综合以上结果,无论在短期摄取高浓度葡萄糖溶液(OGTT)或是长时间摄取高脂饮食所诱导之高血糖状态,副干酪乳杆菌GKS6都能有效降低血糖浓度,其具有开发成降血糖功效之保健食品潜力。
NOTES
*通讯作者。