1. 引言
随着水产品在人类日常生活的中的广泛普及，水产品中药物的残留问题已成为人们关注的焦点，如何促进药物在水产动物体内中的吸收与转化、减少药物在体内的残留已成为迫切需要解决的问题。细胞色素P450是重要的一类肝脏药物代谢酶，对药物在体内的代谢起着至关重要的作用，与药物的毒理研究也密切相关 [1] - [10] ，P450酶系包括CYP1A、CYP2B、CYP2E1等亚家族，其中细胞色素CYP1A与药物的相互作用有关，占肝脏总氧化酶含量的13%，代谢临床上5%~10%的常规应用药物 [11] 。目前，已知可被CYP1A催化代谢的药物有非那西丁、咖啡因、茶碱、三环类抗抑郁药、氯氮平、普萘洛尔和美西律等。CYP1A还与癌症、炎症、心肌梗死等疾病的发病易感性也相关 [12] [13] [14] 。有学者报道，食用残留大量烟酸诺氟沙星药物的水产动物可能导致肝代谢干扰作用，破坏和减少体内红细胞、白细胞等毒副效应 [15] ，因此深入研究不同浓度烟酸诺氟沙星对CYP1A的活性影响具有重要的意义，为有效地预防药物等外源化合物引起的疾病提供一定的临床指导。CYP2B是CYP450酶中参与口服药物首过效应的主要酶系 [16] ，与药物代谢的去甲基化也密切相关，参与临床上约60%药物的代谢，具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解毒作用，因此研究该酶，对药物在体内代谢与排除具有指导作用。CYP2E1在药物和人们经常接触的溶剂与环境污染物的代谢中具有重要作用，在体内承担6大类、70余种低分子化学物质的代谢 [17] ，如乙醇、蒽氟烷、氟烷、氯唑沙宗、对乙酰氨基酚及烟草中的许多成分等均通过CYP2E1在体内进行生物转化，CYP2E1不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化。迄今发现所有CYP2E1的底物在人和动物中都是相同的，因此研究动物的CYP2E1对人具有重要参考意义 [18] 。氨基比林、红霉素、盐酸苯胺分别是CYP1A、CYP2B、CYP2E1的特异性底物，通过测定苯胺-4-羟化酶(AH)催化盐酸苯胺生成4-氨基酚、以及氨基比林-N-脱甲基酶(AND)催化氨基比林和红霉素-N-脱甲基酶(ERND)催化红霉素生成甲醛的速度，可以间接地测定细胞色素P450酶系CYP1A、CYP2B、CYP2E1的活性。
P450酶系的活性能被许多化合物诱导或抑制，从而引起药物代谢的改变，进而引起由药物蓄积或药物相互作用引发的毒性或药效降低反应。目前关于烟酸诺氟沙星对水产品药物代谢酶的研究尚不多见，对食用鱼体内的CYP酶的情况还不清楚。本文通过主要养殖鱼类乌鳢(Channa argus)为研究对象，提取其肝微粒体，研究不同浓度烟酸诺氟沙星对肝微粒体P450酶系的活性影响，有助于研究乌鳢对烟酸诺氟沙星代谢的速率及该药与其他药物的相互作用，为进一步探讨烟酸诺氟沙星对乌鳢的合理用药奠定基础。
2. 材料与方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 试验动物
乌鳢(Channa argus, 200 ± 20.0 g)，由浙江菱湖某水产养殖场提供，饲养于浙江省淡水水产研究所动物房恒温循环式水槽中。试验前对乌鳢进行适应性饲养1周，水温(26 ± 1)℃，正常充氧并投喂饲料。
2.1.2. 试验药物及试剂
烟酸诺氟沙星(原料药)购于中国兽医药品监察所，批号兽药字HO150904；BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天；盐酸苯胺、三氯乙酸、红霉素、细胞色素C、EDTA、氨基比林、Ba(OH)2、NADPH、醋酸铵、乙酰丙酮、Tris均购于阿拉丁。实验所需试剂均由双重去离子水配置。
2.1.3. 仪器与设备
酶标仪；紫外分光光度计；恒温水浴锅；高速离心机；超高速离心机。
2.2. 试验分组、给药与采样
分别称取烟酸诺氟沙星1.5 g、6 g、12 g，与一定量粉碎均匀的乌鳢饲料充分拌匀，加入适量的纯净水，将其溶解形成糊状饲料，直到糊状药饵体积为30 mL，制备的药饵中烟酸诺氟沙星的理论含量分别为50 mg/mL、200 mg/mL、400 mg/mL，按100 g鱼体重给药1 mL。
将试验乌鳢随机分为4组，每组15尾，各实验组分别给予烟酸诺氟沙星5 mg/kg (低剂量组)、20 mg/kg (中剂量组)和40 mg/kg (高剂量组)，空白对照组喂食不添加药物的饲料，实验组每天上午10点按药的剂量口灌给药1次，连续处理5天，无回吐者保留试验，最后一次给药后1 h采集肝脏，测定各组乌鳢肝微粒体的蛋白含量、肝细胞色素P450酶系[NADPH-细胞色素C还原酶、氨基比林-N-脱甲基酶(AND)、红霉素-N-脱甲基酶(ERND)、苯胺-4-羟化酶(AH)]的活性。
2.3. 肝微粒体的制备
取出肝脏用预冷的生理盐水冲去血渍，用差速离心法制备肝微粒体，即称取肝脏4 g，放入小烧杯中剪碎后按1:3(W:V)的比例加入预冷的匀浆缓冲液(0.05 mol/L Tris-HCl，0.2 mol/L蔗糖，3 mol/L MgCl2，pH = 7.4)，用电动匀浆器在冰水浴中匀浆。匀浆液4 ℃、12,000 rpm高速离心20 min，上清液4 ℃、50,000 rpm超速离心60 min，红色沉淀即为肝细胞微粒体组份。将微粒体沉淀取出后用含250 mL/L甘油的KCl-磷酸盐缓冲液定容到4 mL，将肝微粒体充分混匀配成微粒体悬液，分装于冻存管中，标记后于−80℃存放。
2.4. 肝微粒体蛋白含量的测定
参照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作。
2.5. NADPH-细胞色素C还原酶(NCCR)活性的测定
取解冻好的微粒体悬液0.2 mL、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(含0.1 mmol/L EDTA) 5.6 mL、5 mg/mL细胞色素C溶液0.2 mL于试管中，混匀，等量分装于对照杯和样品杯，样品杯内加5 mg/mL NADPH溶液20 µL，立即混匀于550 nm处测定吸光度，秒表计时，每30 s测定1次D550值连续测5 min，按下式计算结果：还原型细胞色素C活性[nmol/(mg∙min)] = ΔD550nm/t × 1000 ÷ (19.1 × 稀释后的蛋白浓度) (mg/mL)，式中t为时间。
2.6. AND活性的测定
2.6.1. 甲醛标准曲线的制备
取0、0.1、0.2、0.4、0.8和1.0 mL浓度为0.1 μmol/L甲醛工作液，各管用超纯水补足至2.0 mL，加入Nash试剂2.0 mL，60℃水浴10 min，自来水冷却，以空白管调零，420 nm处测定各管的吸光度，以D420nm值为纵坐标，甲醛浓度为横坐标，绘制甲醛标准曲线。
2.6.2. AND活性测定
取含250 mL/L甘油的KCL-磷酸盐缓冲液1.7 mL，加微粒体蛋白悬液0.1 mL，20 mg/mL氨基比林溶液0.1 mL，于37℃水浴温孵2 min后，测定管加10 mmol/L NADPH溶液0.1 mL，空白管加蒸馏水0.1 mL于37℃水浴30 min，各管均加150 g/L ZnSO4 0.35 mL，混匀，冰浴5 min，加饱和Ba(OH)2 0.35 mL混匀放置5 min后3000 r/min离心5 min，取上清液2 mL加Nash试剂2.0 mL，以后操作同甲醛标准曲线制备，根据标准曲线计算酶活性，以甲醛的产生速度表示AND的活性。甲醛 [nmol/(mg∙min)] = ΔA420nm × K × 4 ÷ t (K从标准曲线上获得，式中t为时间)。
2.7. ERND活性的测定
反应体系中，20 mg/mL氨基比林溶液换成浓度为0.4 mmol/L的红霉素，其余步骤同AND活性的测定。
2.8. AH活性的测定
2.8.1. 4-氨基酚标准曲线的制备
取5 µmol/mL 4-氨基酚0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用60 g/L的TCA补足至1 mL，加1 mL碳酸钠溶液(1 mol/L)，混匀，室温放置30 min，空白管调零，630 nm处测吸光度。以D630 nm值为纵坐标，4-氨基酚浓度为横坐标，绘制氨基酚的标准曲线。
2.8.2. AH活性的测定
取1 mL NADPH溶液(1 mmol/L)和0.5 mL盐酸苯胺溶液，置于10 mL试管内混匀，对照管加0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4) 1.0 mL取代NADPH溶液，37℃水浴2 min。各管加0.5 mL微粒体悬液，37℃水浴再温孵30 min，加1 mL冰冷的200 g/L TCA，冰浴5 min终止酶反应。然后，11000 r/min离心10 min，取1 mL上清液于另一试管，以后操作同4-氨基酚标准曲线的制备，根据D630nm值和标准曲线计算酶活性，以4-氨基酚的生成速度表示AH的活性[nmol/(mg∙min)]。4-氨基酚[nmol/(mg∙min)] = ΔA420nm × K × 4 ÷ t (K从标准曲线上获得，式中t为时间)。
2.9. 数据处理
将试验所得各组数据采用Microsoft Excel软件进行统计分析，结果应用标准差(mean ± SD)形式表示，用t检验进行平均数间的差异显著性分析，用SPSS软件进行组间多重显著性分析，研究比较各浓度药物对酶活性的影响差异。
3. 实验结果
3.1. 肝微粒体总蛋白质含量的测定
3.1.1. BCA蛋白标准曲线绘制
以系列浓度的牛血清白蛋白(BCA)为横坐标，A = 562 nm值为纵坐标得到的标准曲线见图1，其线性回归方程为y = 0.0514x + 0.0082，r2 = 0.9988。
3.1.2. 烟酸诺氟沙星对乌鳢肝微粒体总蛋白质含量的影响
根据牛血清白蛋白标准曲线，计算乌鳢肝微粒体总蛋白质含量，结果见表1，由表可知：给予不同剂量烟酸诺氟沙星后，与对照组相比，低剂量组肝微粒体蛋白含量无显著变化(p > 0.05)，中、高剂量组肝微粒体总蛋白质含量均显著降低(p < 0.05)。
3.2. 烟酸诺氟沙星对乌鳢肝微粒体NCCR、AND、AH、ERND活性的影响
3.2.1. 甲醛标准曲线
以系列浓度的甲醛为横坐标，A = 420 nm值为纵坐标得到的标准曲线见图2，其线性回归方程为y = 0.0887x + 0.0011，r2 = 0.9996。
3.2.2. 4-氨基酚标准曲线
以系列浓度的4-氨基酚为横坐标，A = 630 nm值为纵坐标的标准曲线见图3，其线性回归方程为Y = 0.0288x + 0.0004，r2 = 0.9997。
3.2.3. 烟酸诺氟沙星对乌鳢肝微粒体细胞色素P450酶系活性的影响
利用紫外分光光度法测定细胞色素P450酶系的活性，结果见表2。给予不同剂量烟酸诺氟沙星后，与空白对照组相比，各剂量组对各酶活性的影响上存在着差异。低剂量(5 mg/mL)对各酶活性都无显著影响(p > 0.05)，中剂量(20 mg/mL)对AND和AH活性产生显著促进作用(P < 0.05)，高剂量(40 mg/mL)对NCCR、AND、ERND、AH活性均产生显著促进作用(P < 0.05)。结果提示，随着药物浓度的升高，NCCR、AND、ERND、AH活性也相应的提高，烟酸诺氟沙星对乌鳢肝微粒体细胞色素P450酶系活性具有促进作用。
Figure 1. Standard curve of bovine serum albumin
图1. BSA标准曲线
Table 1. Effect of niacin norfloxacin on Channa argus hepatic microsomes proteins
表1. 烟酸诺氟沙星对乌鳢肝微粒体总蛋白含量的影响
与对照相比：*P < 0.05。
Figure 3. Standard curve of 4-aminophenol
图3. 氨基酚标准曲线
4. 讨论
4.1. 烟酸诺氟沙星对乌鳢CYP450酶活性产生诱导作用
烟酸诺氟沙星具有杀菌力强、抗菌谱广、安全性高、无交叉耐药性、价格低廉等优点，因此被广泛应用于治疗鱼、虾、蟹、鳖等水产养殖动物由于细菌感染引起的出血病、肠炎、赤皮病、烂鳃病、体表
Table 2. Effect of niacin norfloxacin on activities of CYP450 in Channa argus hepatic microsome
表2. 烟酸诺氟沙星对乌鳢肝微粒体细胞色素P450酶系活性的影响
与对照相比：*P < 0.05。
溃疡病、竖鳞病、白云病等疾病的治疗与防治 [19] 。烟酸诺氟沙星属于第三代氟喹诺酮类抗菌药，目前对于该类药物对细胞色素P450酶系影响的研究已有报道。HU (2010年) [20] 等以鲤鱼作为研究对象，研究恩诺沙星(EF)对鲤鱼肝微粒体CYP1A和CYP3A的影响，其结果表明EF对蛋白浓度有抑制作用，对CYP1A和CYP3A活性和mRNA的表达也表现抑制作用。戴静(2009) [21] 通过体外探针法研究8种氟喹诺酮类药物(FQ，环丙沙星、二氟沙星、沙拉沙星、洛美沙星、达氟沙星、氧氟沙星、恩诺沙星和诺氟沙星)对鸡和猪肝微粒体中CYP1A2的影响和作用机制。结果表明8种FQs均可抑制CYP1A的活性。Mayeauc (1998) [22] 和陈大健(2006) [23] 研究发现EF对美国鳄鱼和鲤鱼肝微粒体CYP450含量有显著抑制作用。贾娴(2009) [24] 研究发现EF对异育银鲫肝微粒体细胞色素P450酶系中CYP1A和CYP3A活性和蛋白质的表达均具有抑制作用等。而本文研究以乌鳢作为研究对象，研究烟酸诺氟沙星对NCCR、AH、AND、ERND4种酶活性的影响，结果表明随着药物浓度的增加，NCCR、AH、AND、ERND几种酶的活性也逐渐增加。表明烟酸诺氟沙星对该酶系具有诱导作用。产生这种差异可能与药物的种类有关，抑或是具有种属的差异 [21] [25] - [29] ，另外剂量的不同也会对药物代谢参数产生影响。本文的给药剂量是参考文献 [30] [31] [32] ，中剂量是按烟酸诺氟沙星的国标渔药使用说明(20 mg/kg)选择，高剂量是中剂量的两倍，低剂量是中剂量的四分之一。
4.2. 检测指标的选择
细胞色素P450是一组主要存在于肝脏的酶系，在外源物质的代谢中，尤其是药物和毒物的代谢，具有重要作用 [33] - [40] 。NCCR作为P450酶系的重要一员，主要负责催化氧化型细胞色素P450还原再生。NCCR催化NADPH还原成氧化型的细胞色素C，还原型细胞色素C在550 nm处有特征吸收峰，通过测定550 nm吸光度的增加速率，来计算NCCR的活性；AH在P450酶系中相当于CYP2E亚型，CYP2E不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。AH催化盐酸苯胺羟化后产生4-氨基酚，4-氨基酚进一步转变为酚–吲哚化合物，在630 nm处有特征吸收峰，通过测定630吸光度增加速度即可计算AH活性；AND作为P450酶系的重要一员，相当于CYP1A亚型，与药物的去甲基化反应密切相关，AND催化氨基比林释放甲醛，通过Nash比色法测定甲醛的含量，即可计算AND的活性；ERND在P450酶系中相当于CYP2B亚型，与药物代谢的去甲基化密切相关。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解毒作用，也可使某些药物经CYP2B代谢。ERND催化红霉素释放甲醛，通过Nash比色法测定甲醛的含量，即可计算出ERND的活性。通过测定NCCR、AH、AND、ERND的活性，可以间接地测定肝细胞色素P450酶系细胞色素C还原、CYP1A、CYP2B、CYP2E1的活性的变化 [37] ，有助于阐明药物的代谢及毒副作用，且可用于评价药物的安全性，指导临床合理用药，减少药物不良反应的发生，并对药物相互作用的预测奠定了一定的研究基础。
4.3. 烟酸诺氟沙星对乌鳢的合理用药指导
细胞色素P450诱导或抑制是引起药物间相互作用的主要因素。药物相互作用是指两种或两种以上的药物同时或先后顺序联合用药时，在药物代谢过程中产生的相互干扰作用，导致药效增强甚至产生毒副作用，或药效减弱甚至治疗失败。一些活化物对细胞色素P450某一亚型的诱导或抑制作用导致该亚型代谢的药物的药效或药动发生明显变化，从而引起药物间的相互作用。药物间潜在的相互作用是国外新药临床使用前，评价其安全性的重要指标。通过预测候选药可能存在的相互作用，上市后尽量避免或减少可与该类药产生代谢性相互作用的药物联合应用，就可减少因代谢相互作用产生副作用 [22] 。药物在体内代谢一般会引起肝微粒体代谢酶活性的激活或抑制，通过CYP450的诱导可增加生物的转化率，从而降低药物的浓度，使药物作用降低，而抑制CYP450则可增加其代谢的药物浓度，延长药物作用时间，也可增加药物的不良反应 [20] 。本研究结果发现随着药物浓度的增加，NCCR、AH、AND、ERND几种酶的活性表现出明显的上升趋势，说明NCCR、AH、AND、ERND参与烟酸诺氟沙星在乌鳢体内的代谢，且对乌鳢肝微粒体主要药酶具有诱导作用，并有随着药物剂量增加酶活性表现增强的趋势，提示烟酸诺氟沙星在乌鳢体内的使用风险系数较低。该药与其他药物联合使用时，应根据监测的血药浓度的结果适当增加药物的用量，以防药效降低，达不到治疗效果或是治疗失败。
基金项目
国家公益性行业(农业)科研专项(201203085)。