低盐度胁迫对拟穴青蟹初期稚蟹成活率的影响

Effects of Low Salinity Stress on Survival Rate of Juvenile Mud Crab

摘要: 实验以拟穴青蟹(Scylla paramamosain)初期稚蟹为研究对象，采取盐度骤降和渐降方式，设计不同盐度梯度，观察稚蟹的成活率，旨在探索稚蟹对盐度的适应能力。结果表明：初期稚蟹耐低盐度胁迫的能力强，从自然海水盐度(S23)骤降至18和13，又从13骤降至10和5，均维持在80%以上成活率，变态率在67%以上，组间无显著差异(p > 0.05)，稚蟹适宜盐度范围扩大至下限值5，稚蟹变态成活率与盐度的关系符合幂函数曲线方程，y = 0.2309Χ − 0.5894，(R2 = 0.98)。稚蟹C5的12 h、24 h、48 h和C4的96 h半致死盐度(LS50)分别为0.017、0.150、0.173和0.236。种蟹对盐度适应能力具有遗传性，生活在盐度较高的海南种蟹繁育的稚蟹与三门湾种蟹选育后繁育的子代对盐度的适应能力存在显著差异(p < 0.05)，选育的蟹适应低盐度环境的能力更强。通过低盐度驯化，拟穴青蟹可以在盐度0.20的环境中生长，大大拓展青蟹养殖区域空间。

Abstract: In order to explore the adaptability of juvenile mud crabs to salinity, the experiment designed dif-ferent salinity gradients and observed the survival rate of juvenile mud crabs. The result shows that: The juvenile mud crabs had a strong ability to tolerate low salinity stress in the early stage. The levels of seawater salinity were S23, S18, S13, S10 and S5. The survival rate of juvenile crabs was above 80%, the metamorphosis rate was above 67%, and there was no significant difference between groups (p > 0.05). The salinity that juvenile mud crabs adapt extends to the lower limit of 5. The relationship between metamorphosis rate and salinity of juvenile crab accords with the power function curve equation, y = 0.2309X − 0.5894 (R2 = 0.98). The semilethal salinity (LS50) of juvenile crab C5 at 12 h, 24 h, 48 h and C4 at 96 h was 0.017, 0.150, 0.173 and 0.236, respectively. The adaptability of mud crabs to salinity was inherited. The adaptability to low salinity was sig-nificant difference between the offspring of mud crabs bred from Hainan province and Sanmenwan Zhejiang province (p < 0.05), and the breeding crab is more capable of adapting to low salinity environment. Through low salinity domestication, the mud crab can grow in a salinity of 0.2, which can greatly expand the area of mud crab culture.

1. 引言

青蟹是重要的海洋经济蟹类和养殖对象 [1] [2] ，盐度是影响水生生物生存的重要环境因子。国内外学者有过诸多研究，青蟹为广盐性的海产蟹类，能在咸淡水甚至接近淡水中成长、发育，能在盐度4~55的海水中生存。由于各海区的青蟹所处的海水盐度不同，因而形成的适应能力亦有些差异 [1]。王桂忠 [3] 研究了盐度对青蟹幼体成活率与生长发育的影响，亓磊 [4] 研究了盐度对大眼幼体生长发育，陈建明 [5] 研究了拟穴青蟹大眼幼体和稚蟹对盐度的适应性，Stickle等 [6] 研究了盐度对2种青蟹(Callinectes sapidus, C. similis)生理和行为的影响，乔振国 [7] 研究了环境因子变化对锯缘青蟹后期幼体及仔蟹变态成活率的影响。但有关文献资料尚未有拟穴青蟹初期稚蟹对低盐度胁迫进行相对系统的研究，以及对低盐度的半致死浓度和生活在不同海区的青蟹耐低盐能力的研究，也无涉及青蟹稚蟹淡化(驯化)方法的研究报道。为此，开展本实验研究旨为青蟹养殖提供参考和技术依据。

2. 材料与方法

2.1. 实验材料

2017年7~8月，实验在宁波市海洋与渔业研究院科技创新基地生态实验室进行。实验桶分为0.5 m³圆形桶和0.1 m³玻璃水槽两种，每个桶配置1个充气石，连续充气，有气阀调节气量大小，每个桶放置一条附着网绳。实验用稚蟹为自繁的拟穴青蟹(Scylla paramamosain)稚蟹，随机选择完整健壮活泼的3日龄稚蟹C1若干。实验用海水采用自然海水(S23)加淡水，海水经过砂滤处理，淡化的海水提前配置完成备用。实验室为自然光照，实验期间水温27℃~28℃。以卤虫无节幼体或冷冻桡足类为饵料，日投喂量以仔蟹能饱食为宜，每天早上换水1次，换水量50%~100%，同时清除残饵和排泄物，并记录死亡、蜕壳等情况。

2.2. 实验方法

2.2.1. 稚蟹耐低盐实验

采取阶梯式方法，从自然海水盐度S23至S0，分为三个大组，A；自然海水(S23)下降至S5，B；从S5下降至S0.25，C；从S0.2调至S0。A组分为A-1、A-2，B组分为B-1、B-2和C组，A-1设对照组和实验组，上一实验最低值组多为对照组，每组设3个平行组，其他组依次类推。每个梯度实验桶，预先加淡水配置好盐度，盐度用哈希多用途水质检测仪测量。每个梯度设多个相应盐度的实验桶，培育稚蟹作为下一梯度实验用，A-B的实验桶为0.5 m³圆桶，C的实验桶为0.1 m³的水槽，A和B组稚蟹300 ind，C组稚蟹50 ind。根据稚蟹变态时间设定每个梯度的实验时间，见表1。实验开始时盐度骤降幅度大，之后，越接近临界值下降幅度越小，以尽量减少对稚蟹的应急刺激。

Table 1. Experimental design table

表1. 实验设计表

2.2.2. 不同品系稚蟹耐盐对比实验

选择海南品系(HN表示)和选育的“甬渔快优”(YY表示)进行比较，实验设计同上。

2.2.3. 稚蟹半致死盐度实验

将C4驯化至盐度S1后，放置于S1、S0.5、S0.3的实验水槽中，观察96 h，将C5驯化至盐度S0.20后放入盐度S0.1和S0.0的实验水槽中，实验开始后12 h、24 h、48 h，记录稚蟹死亡数和变态数。

2.3. 分析统计方法

成活率(%) = (稚蟹存活数/初始稚蟹数) × 100

死亡率(%) = (稚蟹死亡数/初始稚蟹数) × 100

变态成活率(%) = (变态后的稚蟹数/初始稚蟹数) × 100

实验数据运用SPSS19.0软件进行统计分析，成活率、死亡率和变态成活率数据用平均值 ± 标准误差(M ± SD)表示，采用方差分析(ANOVA)比较实验组别和不同品系稚蟹耐盐能力的差异，p < 0.05为显著差异，曲线回归分析成活率与盐度的关系方程，参照李翠萍 [8] 驯化式半致死浓度方式和半致死浓度计算方法计算半数致死量。

3. 实验结果

3.1. 低盐度胁迫对初期稚蟹死亡率的影响

稚蟹C1从自然海水(S23)骤降至S18和S13，降幅分别为S5和S10，从表2中所示，两组实验24 h时，C1的成活率均在80%以上。盐度从S13骤降至S10和S5，降幅分别为3和8，48 h稚蟹C3的成活率94%以上，各组间没有显著差异(p > 0.05)。说明稚蟹(C1, C3)盐度S23至S5均为适宜范围。

Table 2. Statistics on survival rate of juvenile mud crab

表2. 稚蟹成活率统计表

盐度从S5逐渐下行至S1.5时，死亡率并没有显著下降，但从S1和S0.5、S0.3实验组，死亡率显著提升(p < 0.05)。随着盐度从S0.3继续下行，死亡率呈现上升趋势，S0.1时，C5的死亡率达到94.3%，见图1。

备注：a表示显著差异。

Figure 1. Comparison of juvenile crab mortality at different salinity

图1. 盐度与稚蟹死亡率的关系

稚蟹死亡率与盐度的关系，极其显著(p < 0.01)，符合反函数曲线方程(INV)、对数曲线方程(LOG)和幂函数曲线方程(POW)，相关指数R²以幂函数曲线方程(POW)最优，曲线拟合程度最紧密，见表3，图2。

3.2. 低盐度胁迫对初期稚蟹变态率的影响

稚蟹C3在盐度S5~S3时，变态率分别为(68.00 ± 0.00)%和(67.00 ± 0.05)%，各组间无显著差异(p > 0.05)，该盐度条件下稚蟹可以正常生长蜕壳。盐度S3~S1.5时，稚蟹C4的变态率出现差异，S0.25~S0.5盐度越低反而比S1的变态率高，S0.5的变态率(23.30 ± 0.20)%，S1的变态率(6.70 ± 0.06)%，盐度低促进蜕皮加快，出现应急反应蜕壳现象。见图3。

Table 3. Regression equation of salinity to mortality of juvenile mud crab

表3. 盐度对稚蟹死亡率回归方程

Figure 2. Curve fitting of salinity and juvenile crab mortality

图2. 盐度与死亡率的曲线拟合图

备注：a、b表示显著差异。

Figure 3. Comparison of metamorphosis survival rate of juvenile mud crab

图3. 稚蟹变态率对比图

3.3. 不同品系稚蟹耐低盐能力

盐度S5和S3时，海南品系(HN)对低盐度的适应能力显著低于“甬渔快优”(YY)品系(p < 0.05)，而盐度降至S0.25以下时，两种蟹的死亡率没有显著差异(p > 0.05)，见图4，说明这两种蟹对极低盐度的适应能力接近。

3.4. 稚蟹的半致死盐度

通过盐度逐步下降适应后，将稚蟹C5置于盐度S0.2、S0.1、S0.0的三个实验桶中进行48 h，C4置于盐度S1、S0.5、S0.3实验水槽96 h致死实验，从实验结果得出稚蟹C5的12 h、24 h、48 h和C4的96 h的半致死盐度(LS₅₀)分别为0.017、0.150、0.173和0.236。半致死盐度模型方程符合 $P=b_0+b_1Х$ ，拟合优势检验结果差异不显著(p > 0.05)，模型拟合良好，见表4。

备注：a、b表示显著差异。

Figure 4. Comparison of mortality rates of two strains of C3

图4. 两种品系C3死亡率对比图

Table 4. Semi lethal salinity of juvenile mud crab

表4. 初期稚蟹半致死盐度值

4. 讨论与分析

4.1. 初期稚蟹对低盐度的适应性

拟穴青蟹对低盐度的适应能力强于高盐度的适应能力，盐度是影响甲壳动物幼体存活率和发育速度的重要环境因子之一 [3]。乔振国 [6] 介绍Cl~C4的盐度适宜范围在2l~8，最适盐度15，在28以上的高盐环境中培育C3以上的仔蟹，会出现变态时间间隔延长和蜕壳不遂致死等现象。盐度10.6~26.5时，盐度对稚蟹的成活率无影响 [5]。将2日龄拟穴青蟹大眼幼体从盐度32环境直接移入盐度6.4~25.6环境条件下，幼体的生长发育和存活率因盐度环境突降幅度的不同而呈现较大的差异。其中，盐度12.8、19.2处理组大眼幼体变态为C，盐度6.4处理组幼体全部死亡，，说明在拟穴青蟹的大眼幼体阶段，适当降低培育盐度将有助于提高育苗效果，但盐度的突降幅度已超出幼体的自身调节能力极限。由此推测拟穴青蟹大眼幼体对盐度突降的适应能力应该在盐度6.4以上，最适盐度为19.2 [4]。梭子蟹幼蟹可较好地适应盐度的逐渐变化，在适宜盐度范围内渐变，幼蟹存活率高。同时，盐度在逐渐降低过程中幼蟹的存活率和变态率均高于盐度逐渐升高 [9]。逐级淡化，三疣梭子蟹II期幼蟹可在盐度为6.7的水环境中存活和生长 [10]。

适当的低盐胁迫对其生存和蜕壳具有一定促进作用 [9] ，但盐度骤降幅度过大和盐度过低，稚蟹在接近盐度下限临界值时，变态率出现波动。幼蟹死亡大多由蜕壳死亡综合征 [6] ，实验观察到S0.3~0.5时，C4死亡主要也是蜕壳困难所致。

半致死浓度反映生物的耐受性 [8]。通过对刺参低盐的半致死时间的评价，不同选育群体的群体表现出良好的低盐耐受能力 [11]。罗非鱼在每天将盐度提高8%的情况下，其半致死盐度为(112.93 ± 4.87)%，驯化致死盐度为128%~136%，莫荷罗非鱼经过驯化可以耐受更高盐度的水环境 [12]。程熙 [13] 日本沼虾幼虾在不同盐度条件下的半致死时间。脊尾白虾盐度突变对脊尾白虾成活率影响大，盐度从6下降至0，8 h后的成活率下降至44%，对低盐度的适应能力弱 [14]。天津厚蟹对低盐的耐受力较强，在盐度0的水体可以存活96 h [15]。

本实验结果分析，盐度从23骤降至18、13直至5，稚蟹顺利变态至C2，变态成活率不受影响。稚蟹的适宜盐度范围扩大至下限值5。从稚蟹(C5) 48 h的半致死盐度0.173，推测青蟹可以环境盐度0.20的水域中生长、养殖。

4.2. 不同品系稚蟹对低盐度胁迫的适应性

不同地理群体和选育的蟹耐盐度能力有差异，盐度对不同遗传背景的三疣梭子蟹群体幼蟹的影响存在差异 [16]。三疣梭子蟹“黄选1号”具有较强的渗透压调节能力，适应更低的盐度 [17]。盐度对拟穴青蟹的存活情况有一定的影响，5个地理种群拟穴青蟹仔蟹在盐度为12~24时存活数较高。在盐度为6和12时，海南和三门种群比其它种群生长表现要好 [4]。

实验结果分析，盐度S5和S3时，海南品系(HN)对低盐度的适应能力显著低于甬渔快优(YY)品系(p < 0.05)。海南品系的种蟹生活在高盐度的海区，选育的“甬渔快优”(YY)生活在浙江三门湾海区的盐度范围20~26，两个品系对低盐度的适应性状在实验中有所表现，以上青蟹耐盐的遗传性状，可为选育适应低盐度的新品种提供参考。

4.3. 稚蟹的盐度淡化方法

拟穴青蟹在低盐度水域养殖，需要解决蟹苗尽快适应低盐度环境，因此，淡化方法十分重要。稚蟹淡化采取骤降与驯化结合的方式，在盐度18和5设立两个“阶梯平台”是十分有效的。如自然海水骤降至S18或S13，然后再骤降至S5，在“平台”上稳定2 d。

降低幼体培育盐度，可以压缩稚蟹淡化的时间。青蟹幼体期对于低盐度同样表现出很强的适应性。锯缘青蟹幼体有较宽的盐度耐受范围 [3] ，拟穴青蟹大眼幼体生长的最适盐度为19.2，适宜生长盐度下限在12.8~19.2之间，生存盐度下限在6.4~12.8之间 [4]。拟穴青蟹大眼幼体适宜盐度为20.5~26.5，幼蟹适宜盐度10.5~26.5 [5]。笔者开展拟穴青蟹蚤状幼体盐度实验，将2日龄的蚤状幼体Z1，在水温25.57℃ ± 0.68℃，微充气条件下，盐度S22组的ZI幼体变态成活率比较盐度S26组的高，盐度S22组Z1幼体成活率 > 80%。通过降低幼体培育盐度，缩短蟹苗淡化时间是完全可能的。

5. 结论

初期稚蟹耐低盐度胁迫的能力强，从自然海水盐度(S) 23骤降至18和13，又从13骤降至10和5，均维持在80%以上的成活率，组间无显著差异(p > 0.05)，稚蟹的适宜盐度范围扩大至下限值5。稚蟹变态成活率与盐度的关系以幂函数曲线方程最优， $y=0.2309{\rm X}-0.5894$ (R² = 0.98)。逐渐降低盐度稚蟹C5的12 h、24 h、48 h和C4的96 h半致死盐度(LS₅₀)分别为0.017、0.1500、0.1734和0.236。种蟹对生活海域环境盐度具有遗传性，生活在盐度较高的海南种蟹繁育的稚蟹与三门湾种蟹选育后繁育的子代对盐度的适应能力存在显著差异(p < 0.05)，选育的蟹适应低盐度环境的能力更强。通过低盐度驯化，拟穴青蟹可以在盐度0.20的环境中生长。

致谢

宁波大学海洋学院喻国洪、王蒙恩两位同学参与实验工作。

基金项目

浙江省宁波市重大科技攻关项目(2016C11003)。