1. 引言
脉络膜介于巩膜和视网膜之间，富含血管和黑色素。脉络膜厚度定义为视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)高反射线外缘至巩膜内层反射线的垂直距离。组织学上从外向内主要包括脉络膜上组织(构成脉络膜上腔)、大血管层、中血管层、脉络膜毛细血管层和Bruch膜，具有多种重要功能，如温度调节，血液供应等 [1]。目前发现其厚度变化与糖尿病视网膜病变、近视性黄斑病变、AMD等疾病相关，在这些疾病中发现脉络膜厚度都出现了变薄的现象 [2]；高度近视患者中，脉络膜厚度明显变薄，其程度与等效球镜度及后巩膜葡萄肿高度相关 [3]。目前有许多研究应用光学相干断层扫描(optical coherence tomography, OCT)技术及增强成像技术(EDI)扫描出高清脉络膜全层图像，并对脉络膜厚度进行测量 [3] [4] [5] [6]。本研究中，我们使用EDI技术获得脉络膜全层图像后分别应用Image J软件及Cirrus-HD OCT内置测量软件测量黄斑中心凹下脉络膜厚度，并进行Bland-Altman分析、运用组内相关系数及重复性系数探讨两种软件测量脉络膜厚度的一致性和重复性 [7] [8] [9]，为临床研究提供参考。
2. 对象与方法
2.1. 研究对象
选取2020年6月至2020年12月在深圳市第二人民医院眼科就诊的青少年患者102例204只眼，其中男37例，女65例，年龄7~17岁，平均(10.97 ± 2.05)岁，等效球镜−6.50到0.38 D，平均−2.53 ± 1.26 D。纳入标准：1) 年龄6~17岁，最佳矫正视力 ≥ 1.0，配合OCT的检查，且眼底无明显异常者；2) 排除眼部手术外伤史，眼底病变的患者。本研究内容符合《赫尔辛基宣言》中的伦理学标准。所有患者及其监护人同意参加本研究并签署知情同意书。
2.2. 方法
一般检查：所有入选患者均采用RM-8000B型自动电脑验光仪(日本Topcon公司)进行电脑验光，然后进行主觉验光，屈光度以主觉验光度数为准。视力采用国际标准对数视力表，最佳矫正视力(BCVA)采用小数记录。常规裂隙灯显微镜检查，包括角膜、晶状体。
黄斑中心凹下脉络膜厚度的测量：采用Cirrus HD OCT (Carl Zeiss Meditrc Inc，型号4000)，应用EDI模式，以6 mm线段对黄斑部水平及垂直方向进行五线高清扫描，取经黄斑中心凹0度的线条分析，在高清图像下观察受检者黄斑中心凹下脉络膜形态。脉络膜厚度定义为：视网膜色素上皮高反射线外缘至巩膜内层反射线的垂直距离。采用两种软件测量：1) 用Image J软件测量经过黄斑中心凹水平切面的中心凹下脉络膜厚度；2) 用系统自带测量工具测量经过黄斑中心凹水平切面的中心凹下脉络膜厚度。所有检查均由同一位检查者完成。参考Bland、Altman介绍的方法 [7]，只取第一次测量值进行两种方法间的比较；同时计算每种方法的平均值及重复测量的差值，进行统计学分析。
3. 统计学分析
测量数据在适用条件方面的表现总称为数据行为(data behavior)。应用标准Bland-Altman方法有三个条件：一是差值的平均趋势在测量范围内保持不变，表现为图中散点分布于x轴平行，通过差值与均值的直线回归分析判定；二是差值的散布程度在测量范围内保持一致，表现为图中散点分布在同宽的离散带内即方差齐同，通过差值与均值直线回归分析的残差绝对值对均值的回归分析判定；三是差值的分布呈正态分布，通过直方图和正态性检验判定 [10] [11]。
以SPSS20.0统计软件做相关分析，描述同一样本两种软件测定结果的关系，用Bland-Altman方法及组内相关系数评价两种软件的一致性。Bland-Altman法统计量计算需给出两种软件测量结果差值的均数和95%波动范围，即95%一致限(95% LoA, x ± 2s)；图示以两种软件测量结果的差值为纵轴(y轴)、两种软件测量结果的均数为横轴(x轴)绘制散点图，并在图中用不同的线段标注出反映差值均数、0值和95% LoA的横线(Bland-Altman图)；
95% LoA可通过计算校正后的标准差得到，公式如下图所示：
(1)
(2)
Bland-Altman法的参数估计，需将LoA的抽样误差考虑在内，要对95% LoA的2个限值进行置信区间估计。计算公式：
(3)
重复性系数通过计算每种软件两次测量结果差值的标准差获得，重复性系数既是该标准差的两倍 [7]。公式如下：
(4)
S0代表两种软件重复测量均值之间的差值的标准差；S1代表Image J两次测量SFCT差值的标准差；S2代表Cirrus-HD OCT内置测量软件两次测量SFCT差值的标准差；Sd代表每种软件两次测量结果差值的标准差；
代表两种软件测量结果差值的平均值；n代表每种方法中参与者的样本量。P < 0.05为差异有统计学意义。
4. 研究结果
4.1. 两种软件测量SFCT的数据行为分析
从表1可以看到，本组数据差值趋势保持不变，斜率b = −0.021与0的假设检验，P > 0.05，即斜率与0的差异无统计学意义；两种方法测量值的差值方差齐同(P > 0.05)；同时差值的分布呈正态分布(P > 0.05)，因此，该组数据行为良好(well-behaved data)，满足应用Bland-Altman分析法的条件 [10] [11]。
Table 1. The data behavior measuring SFCT of two kinds of software
表1. Image J和Cirrus-HD OCT内置测量软件测量SFCT结果的数据行为情况
4.2. 两种软件测量SFCT的相关分析
Image J软件及Cirrus-HD OCT内置测量软件测定SFCT的结果分别为224.55 ± 42.91 µm和222.78 ± 43.80 µm；Y = 1.006X − 3.108；R2 = 0.972，P < 0.05。见图1。
Figure 1. Scatter plot of correlation between the measurements of two different methods (R2 = 0.972, P < 0.05)
图1. 两种不同方法测量值之间的相关性散点图(R2 = 0.972, P < 0.05)
4.3组内相关系数
以两种软件测量SFCT的结果为度量变量，我们利用SPSS计算组内相关系数。两组方法学比较ICC值为0.985，95%置信区间为(0.981, 0.989)。
4.4. Bland-Altman分析
两种软件测定差值与对应均值绘制Bland-Altman散点图，以两种软件测量结果的差值为纵轴(y轴)，两种软件测量结果的均数为横轴(x轴)绘制散点图，并在图中用不同的线段标注出反应差值均数、0值和95% LoA的横线，算出两种软件测量结果差值的均数为1.775 µm，95%波动范围(x ± 2s)为−13.956 µm到17.505 µm之间。图2显示，两组方法学比较，95%的LoA区间为约2% (4/204)的点在95%一致性界限以外，在一致性界限范围内，ImgeJ测量与内置软件测量相比，差值的绝对值最大为19 µm。考虑到LoA的抽样误差，我们要对LoA范围进行置信区间的估计。一致性上限的置信区间为15.624~19.386 µm，一致性下限的置信区间为−15.837~−12.075 µm，因此一致性界限的95%置信区间的上下界限之间为−15.837~19.386 µm。所有的点都在该区间内，表明两种软件之间有很好的一致性。
Figure 2. The Bland-Altmann analysis,the graph evaluated the agreement of two different methods.
图2. 两种不同测量方法的Bland-Altmann分析
4.5. 重复性系数
通过公式(4)计算得出的结果，Image J软件的重复性系数为9.069 µm，低于Cirrus-HD OCT内置测量软件的重复性系数(11.276 µm)。
5. 讨论
我们分别使用Image J软件和Cirrus-HD OCT内置测量软件进行黄斑中心凹下脉络膜厚度测量并比较两种软件测量结果的一致性和重复性。我们采用了Bland-Altman分析法，结果显示一致性限度为−13.956 µm到17.505 µm之间，一致性界限的上限95%的置信区间为15.624~19.386 µm，下限95%的置信区间为−15.837~−12.075 µm，一致性界限的95%置信区间的上下限之间为−15.837~19.386 µm，两种软件测量结果的差值都在该区间内；SFCT的ICC值为0.985 (P < 0.05)，以上结果说明两种软件之间有很高的一致性；对于两种软件各自测量的两次结果，Image J的重复性系数(9.0694 µm)低于内置软件(15.176 µm)，说明Image J的两次测量差值的离散程度比内置软件小，重复性更好。
目前，多种OCT能够测量脉络膜厚度，如Heidelberg Spectralis (德国Heidelberg公司)、Topcon3D-2000 OCT (日本Topcon公司)及Zeiss Cirrus HD-OCT (德国Carl Zeiss公司) [3] [4] [5] [6]。Ikuno等人评价了SD-OCT与High penetration OCT两种仪器之间测量脉络膜厚度的可重现性，发现两种仪器测量结果有很高的可重现性 [12]；Lau JK等人则比较SD-OCT两次测量同一位置脉络膜厚度的重复性，结果重复性良好 [13]；而本研究采用的是Zeiss Cirrus HD-OCT，使用EDI模式得到清楚的脉络膜图像，并使用两种测量软件对同一张脉络膜图像测量，发现这两种软件一致性好，Image J软件的重复性系数(9.0694 µm)低于内置测量软件(15.176 µm)，重复性更好。Wei chen等人使用了SD-OCT获取脉络膜图像，同样比较了Image J软件与内置软件测量脉络膜厚度的一致性及重复性，他们的研究中，一致性界限为−18.437~63.949 µm，一致性界限的上限95%的置信区间为16.102 µm到111.796 µm，下限95%的置信区间为−66.29 µm到21.41 µm，因此该研究认为两种方法的一致性界限95%的置信区间过宽，得出两种方法不具备一致性的结论，这与该研究应用了错误的t值计算一致性界限上下限的95%置信区间有关 [14]；他们的研究中Image J的重复性系数为27.3525 µm，内置软件的重复性系数为39.919 µm，远大于本实验的结果。
对于Bland-Altman分析法，其标准的用法有着三个条件需要满足：一是差值的平均趋势在测量范围内保持不变，表现为图中散点分布于x轴平行，通过差值与均值的直线回归分析判定；二是差值的散布程度在测量范围内保持一致，表现为图中散点分布在同宽的离散带内即方差齐同，通过差值与均值直线回归分析的残差绝对值对均值的回归分析判定；三是差值的分布呈正态分布，通过直方图和正态性检验判定 [10] [11]。但在实际中很多研究并未严格按照该标准应用 [15]，本研究数据满足以上3个条件，因此采用了Bland-Altman分析法。
目前应用Bland-Altman一致限LoA进行方法比较研究的一致性评价得到普遍认可，但在研究中不能直接使用差值散点位于95% LoA两个限值之间的百分比是否大于95%，LoA在概念上属于统计描述的范畴，只反映了所测量样本特征，未涉及对总体的推断，为进行一致性的正确评价，需考虑LoA的抽样误差，应对LoA范围进行置信区间估计，即对LoA进行参数估计需要分别进行下限和上限的置信区间估计，但在很多方法学比较研究中很少提供置信区间的估算 [16] [17]。
总之，Image J软件与Cirrus-HD OCT内置测量软件测量脉络膜厚度的一致性高，两者间可相互替代，但Image J软件的重复性较Cirrus-HD OCT内置测量软件好，因此在临床应用中，建议使用Image J软件测量脉络膜厚度。
我们的研究有一些限制，对于脉络膜偏厚的情况下，并非每个图像都能清楚地显示脉络膜–巩膜的边界，这可能增加测量的误差，需要OCT技术进一步的发展解决。