1. 引言
透明质酸(hyaluronic acid, HA)又称玻尿酸，是一种由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺双糖单位通过β-1,3和β-1,4糖苷键交互连接构成的酸性黏多糖 [1]。自1934年由Meyer和Palmer从牛眼玻璃体中首次提取分离成功以来，HA以其独特的保水保湿作用和极佳的生物相容性而受到功能性化妆品、医疗美容领域的广泛关注，被誉为理想的天然保湿因子(natural moisturizing factor, NMF) [2]。然而由于HA的相对分子质量较大，阻碍了对皮肤表面角质层的穿透，寻找合适的透皮吸收促进剂对HA的实际应用具有重要意义。
近年来，国内外科研团队寻找到多种对透皮吸收具有促进作用的中药成分，中药透皮吸收促进剂以其起效快、效果好、副作用小等特点，受到了多方面的关注 [3]。太子参是石竹科植物孩儿参Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.的干燥块根，其味甘、微苦，性平；归脾、肺经；具有益气健脾，生津润肺的功效，含有多种氨基酸、微量元素、多糖、环肽、脂肪酸等活性成分 [4]。
环肽是以太子参为代表的石竹科植物的特征成分，因其结构的特殊性而具有丰富的活性。文献报道小分子的环肽可促进胰岛素的经皮吸收，具有细胞穿透作用 [5]，富含阳离子氨基酸的细胞穿膜肽具有跨膜转运能力 [6]，这在化妆品等产业的应用中是极其重要的。本研究采用改良的Franz扩散池探究太子参提取物对HA的透皮吸收速率影响，并通过单位面积累计透过量及透皮吸收系数评价太子参提取物对HA透皮吸收的促进作用，为太子参在功能性护肤产品中的开发利用奠定基础。
2. 仪器与材料
2.1. 仪器设备
Milli-Q超纯水机，美国Millipore公司；AE240电子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；DK-S22电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；L-550台式离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；R-100旋转蒸发仪，瑞士BÜCHI公司；TP-6透皮扩散仪，天津精拓仪器科技有限公司；DNP-9052隔水式恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；Varioskan Flash多功能酶标仪，美国 Thermo Fisher公司。
2.2. 试剂材料
本实验中使用的太子参产自福建柘荣；生理盐水(250 mL/瓶，产品编号：H35020290)购自福州海王福药制药有限公司；透明质酸(纯度：97%，产品编号：H823435)、月桂氮酮(纯度：97%，产品编号：A800359)均由上海麦克林生化科技有限公司提供；透明质酸(HA)测试盒(产品编号：H141-1-2)购自南京建成生物工程研究所。
2.3. 实验动物
SPF级雄性SD大鼠15只，体重230 g ± 20 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。
3. 实验方法
3.1. 太子参提取物的制备
将太子参粉碎，过三号筛备用。称取100 g太子参粉末，加入超纯水1 L，100℃恒温水浴加热回流提取1 h，冷却至室温后以5000 rpm转速离心15 min收集上清液，将下层药渣重复提取一次。合并离心上清液，减压浓缩后转移至500 mL容量瓶中定容，即得。
3.2. 离体皮肤制备
SD大鼠脱颈处死后用电推剪仔细脱去腹部绒毛，分离腹部皮肤。使用纱布及脱脂棉球钝性分离皮下血管筋膜及脂肪组织，生理盐水反复冲洗至洗液澄清无浑浊。修剪成适宜大小后浸泡于生理盐水中，用于后续实验。
3.3. 供应室溶液配制
HA溶液：称取透明质酸0.50 g，加入100 mL生理盐水，静置2 h后以玻璃棒充分搅拌溶解，即得透明质酸浓度为5 mg/mL的HA溶液。
月桂氮酮-HA溶液：取上述HA溶液50 mL，加入月桂氮酮250 μL，磁力搅拌器辅助溶解均匀，即得月桂氮酮浓度为0.5%的月桂氮酮-HA溶液。
太子参提取物-HA溶液：称取透明质酸0.50 g，加入3.1项下所制太子参提取物溶液50 mL，静置2 h后以玻璃棒充分搅拌溶解，即得太子参提取物-HA溶液。
3.4. 体外透皮吸收实验
采用改良型Franz扩散池，渗透面直径1.5 cm，有效渗透面积约1.767 cm2，接收室容积15 mL。将离体皮肤固定于供应室与接收室之间，锁紧螺母加以固定，角质层面向供应室。接收室内加入生理盐水作为接收液，检查皮肤与接受液之间的接触面是否已排除气泡，确认真皮层与接受液完全接触后，向各组供应室内分别加入3.3项下配制各溶液。将安装好的扩散池37℃恒温300 r/min搅拌，分别于实验开始后1、2、4、6、8、12共计6个时间点抽取接受室内溶液1 mL并以等量生理盐水补足接收室内溶液体积。接受液以0.22 μm滤膜过滤后供后续检测使用。
3.5. HA含量测定
采用酶联免疫分析法测定上述3.4项下采集接受液中的透明质酸含量。向预先包被了抗体的酶标孔中加入样本，再加入生物素标记的识别抗原，在37℃下孵育30分钟，两者与固相抗体竞争结合形成免疫复合物，经PBST洗涤除去未结合的生物素抗原，然后加入亲和素-HRP，在37℃下孵育30分钟，亲和素-HRP与生物素抗原结合，洗涤后结合的HRP催化TMB(四甲基联苯胺)成蓝色，随后在酸的作用下转化成黄色，在450 nm波长下有吸收峰，吸光值与样本中抗原的浓度成负相关。
3.5.1. HA系列标准样配制
取150 μL标准品稀释液到HA标准品干粉管中，漩涡30秒使其充分溶解，即为标准品原液。取5支0.5 mL无酶EP管，每管加150 μL的标准品稀释液，分别标记上400 ng/mL，200 ng/mL，100 ng/mL，50 ng/mL，25 ng/mL。取150 μL标准品原液加入标记400 ng/mL的管中，混匀后同样取出150 μL，加入下一管，以此类推直至最后一管。以标准品稀释液为0 ng/mL标准样，即得HA系列标准样。
3.5.2. 加样孵育
酶标板分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔仅加显色剂A，B和终止液用于调零，余孔分别加标准样或待测样品50 μL，然后加入生物素抗原工作液50 μL，注意不要产生气泡，将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，覆膜，于培养箱内37℃恒温孵育30 min。
3.5.3. 洗涤加酶
弃去孔内液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔加50 μL亲和素-HRP，于培养箱内37℃恒温孵育30 min后，弃去孔内液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
3.5.4. 显色测定
依序每孔先加入显色剂A液50 μL，再加入显色剂B液50 μL，轻轻震荡混匀，于培养箱内37℃恒温避光显色10 min，依序每孔加终止溶液50 μL终止反应，终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。将样本送入酶标仪，以空白孔调零，在450 nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。通过ELISA Calc回归/拟合计算程序根据标准样浓度和对应OD值，计算出标准曲线的回归方程，将待测样品OD值代入计算，测定HA含量。
3.6. 数据处理
HA的单位面积累计透过量及透皮速率常数通过以下公式计算：
式中Qn表示n时间点HA的单位面积累计透过量；A表示有效透皮扩散面积，本实验中为1.767 cm2；Cn代表n时间点接受液HA浓度的测定值，Ci代表n时间点之前接受液HA浓度的测定值；V表示接受池总体积，本实验中为15 mL；Vs表示接受池取样体积，本实验中为1 mL。做Qn对t的曲线得回归方程，其斜率J即为透皮速率常数。
4. 结果与讨论
各组不同时间点接受液中透明质酸浓度ELISA测定结果详见表1，将数据代入上述3.6项下公式可得各样本透明质酸单位面积累计透过量(见表2)，作Qn对t的方程得到各组样品的透皮动力学方程如下：
HA组：
太子参提取物-HA组：
月桂氮酮-HA组：
Table 1. HA concentration in receiving solution (ng/mL)
表1. 接受液中透明质酸浓度(ng/mL)
Table 2. Cumulative transmittance of HA per unit (ng/cm2)
表2. 透明质酸单位面积累计透过量(ng/cm2)
由各组样品的动力学方程可知，在体外透皮吸收实验中，透明质酸的单位面积累计透过量随时间变化线性递增，符合零级动力学方程。与传统的透皮吸收促进剂月桂氮酮相仿，太子参提取物对HA的透皮吸收起到积极的促进作用，太子参提取物-HA溶液组透明质酸的12小时累积透过量是HA溶液组的3.5倍。上述研究表明，太子参提取物对透明质酸的透皮吸收具有一定的促进作用。
随着经皮给药系统(transdermal delivery drug system, TDDs)的研究逐渐深入，众多实验证据证明化学促渗法、脂质载体法等用于突破角质层屏障的传统方法均对皮肤结构具有一定影响，长期使用或将影响皮肤正常生理功能，造成皮肤过敏、水油失衡等不良后果 [7]。天然来源的中药透皮吸收促进剂，因毒副作用小、促透效果好、可实现“药辅合一”等优点，受到学者们的广泛关注 [8]。研究表明，药材中所含的挥发油等脂溶性成份在促进药物透皮吸收的同时，通过调节炎症及氧化应激相关通路对皮肤微生态环境起到调控作用 [9]；生物碱类成分对芍药苷、阿魏酸、丁香苦苷等极性药物亦具有促透作用 [10]。本实验对太子参提取物体外促透效果进行了初步评价，为后续深入研究其具体促透作用机制奠定基础。
基金项目
福建省公益类科研院所专项(2019R1003-7)；福建省自然科学基金项目(2021J01913)；福建省特色药用植物工程技术研究中心开放课题(PP201906)。
NOTES
*通讯作者。