IL-27对小鼠溃疡性结肠炎的治疗作用及机理探讨

Effect and Mechanism of IL-27 on the Treat-ment of Ulcerative Colitis in Mice

摘要: 目的：探讨IL-27对葡聚糖硫酸钠(Dextran sodium sulfate, DSS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎及IL-12家族成员(IL-12, IL-23, IL-27, IL-35)表达水平的影响。方法：用DSS自由饮用法复制Balb/c小鼠溃疡性结肠炎模型。实验设对照(NC)组、模型(UC)组、IL-27高剂量(H)组、低剂量(L)组。造模后，UC组，H组和L组分别予生理盐水、IL-271 μg/20g/天和0.2 μg/20g/天皮下注射治疗4 d，观察一般情况并收集血清和结肠组织标本。用ELISA法检测小鼠血清IL-12、IL-23、IL-27、IL-35的水平，用RT-PCR法检测小鼠结肠组织中IL-27P28、IL-27EBI3、IL-12P19、IL-23P35的相对含量。结果：DAI评分、MPO水平明显增高(P < 0.05)；与UC组相比，H组、L组明显降低(P < 0.05)；小鼠体重、结肠长度、重量及脾脏重量明显降低(P < 0.05)，与UC组比较，H组和L组增高(P < 0.05)。ELISA结果：IL-12、IL-23水平增高(P < 0.05)；与UC组比较H组、L组明显降低(P < 0.05)；与NC组比较，IL-27的表达在UC组稍有增高，H组，L组明显增高(P < 0.05)；与UC组比较，H组，L低明显增高(P < 0.05)；与NC组比较，IL-35的表达在UC组明显降低，H组，L组有所降低升高(P < 0.05)。RT-PCR检测：IL-27P28和IL-27EBI3的mRNA相对含量：与UC组比较，H组和L组明显增高(P < 0.05)；而IL-12P35与IL-23P19的mRNA相对含量显著低于UC组(P < 0.05)。结论：IL-27对UC有防护作用，其机制可能与抑制IL-12、IL-23，促进IL-27、IL-35的表达有关。

Abstract: Objective: To study IL-27 treatment on dextran sodium sulfate (DSS)-induced ulcerative colitis in mice and the expression of IL-12 family members (IL-12, IL-23, IL-27 and IL-35). Methods: Balb/c mice ulcerative colitis model was induced using DSS preparation. The mice were divided into con-trol group (NC), model group (UC), IL-27 high dose group (H), IL-27 low dose group (L). UC group to the physiological saline, H and L groups respectively to the IL-271 μg/20g/day, IL-270.2 μg/20g/day subcutaneous injection treatment for 4 days, observe the general situation and collect serum and colon tissue specimens. with ELISA method to detect the level of IL-12, IL-23, IL-27, IL-35int serum; by RT-PCR method detecting the mRNA relative content of IL-27EBI3, IL-12P19, IL-23P35 in the colon tissue in mice. Results: DAI, MPO level increased significantly (P < 0.05); H and L group compared with UC group significantly decreased (P < 0.05); Body weight in mice, colon length, weight and spleen weight significantly decreased (P < 0.05), compared with UC group, H and L group increased (P < 0.05). ELISA results: IL-12, IL-23 levels increased in UC group (P < 0.05); H, L group IL-12, IL-23 levels significantly decreased (P < 0.05); Compared with NC group, the expression of IL-27 in UC group slightly increased; H, L group significantly increased (P < 0.05); Compared with NC group, the expression of IL-35 in the UC group significantly decreased, H, L group significantly increased (P < 0.05). Rt-pcr detection: IL-27P28 and IL-27EBI3 mRNA relative content: compared with UC group, H and L group significantly increased (P < 0.05); IL-12P35 and IL-23P19 mRNA rela-tive content was significantly lower than UC group (P < 0.05). Conclusion: IL-27 of UC has protective effect, its mechanism may be related to inhibition of IL-12, IL-23, promoting the expression of IL-27 and IL-35.

1. 引言

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，以腹痛、腹泻、黏液血便为主要临床特征，病程较长，易反复发作。由于UC的发病机制尚未完全阐明，其治疗仍是临床上的一大难题。目前认为CD4⁺T细胞和各种炎性因子介导的免疫反应与UC的发生发展关系密切 [1] [2] 。IL-12家族成员是一类异二聚体的炎性细胞因子，包含IL-12、IL-23、IL-27、IL-35，其在影响CD4⁺T淋巴细胞的分化成熟中起着重要作用。其中IL-27是具有促炎和抗炎双重作用的细胞因子，有研究显示IL-27对多发性硬化症 [3] 、类风湿性关节炎 [4] 、实验性自身免疫性心肌炎 [5] 、系统性红斑狼疮 [6] 等具有一定的治疗作用。IL-27是否对DSS诱导的UC小鼠体内IL-12家族成员的表达有影响尚未见报道。本研究拟通过皮下注射IL-27干预DSS诱导的UC小鼠模型，评价其治疗效果和对IL-12其他家族成员的影响，为寻找一种具有开发潜力的治疗UC的新细胞因子调节剂提供理论依据。

2. 材料与方法

2.1. 实验动物

清洁级健康BALB/c小鼠，雌雄各半，6~8周龄，体质量18~22 g，购于广东省实验动物中心。

2.2. 主要试剂及仪器

IL-27购于EBioscience公司，DSS购于Pharmaeia公司(50(X)MW，F0046)。IL-35、IL-23、IL-27ELISA试剂盒购于上海朗顿生物科技有限公司，IL-12、INF-γ购于武汉博士德生物有限公司。PCR反转录、扩增试剂盒购于TAKARA公司。仪器：激光共聚焦显微镜(Olympus公司)；紫外分光光度计(Nano Drop Technologies. Inc公司)；ABI7500PCR仪(ABI公司)。

2.3. 实验动物分组

小鼠习惯性喂养1周后，称重，随机分4组后编号，分别为正常(NC)组，模型(UC)组，IL-27高剂量(H)组，IL-27低剂量(L)组。

2.4. 小鼠UC模型建立

按经典 [7] 方法，给予UC组、H组、L组小鼠自由饮用3.5% DSS水溶液7天，NC组小鼠自由饮用蒸馏水7天。造模期间，每天称重小鼠质量并记录，每天观察小鼠毛色、活动度，睡眠、饮食情况，排便、便血情况，分别记录。取材前记录小鼠体重、大便性状和隐血或便血情况，参照DAI评分方法，作为疾病活动指数(disease activity index, DAI) (如表1)。

Table 1. Rat DAI scoring table

表1. 大鼠DAI评分表

注：计算公式：DAI = (体重下降分数 + 大便性状分数 + 便血分数)/3。

2.5. 给药及标本获取、保存

造模结束后，UC组、H组、L组分别予生理盐水0.2 ml，IL-27水溶液1 μg/20g/天和0.2 μg/20g/天皮下注射4天，每天定时称体重，观察精神、睡眠、饮食情况，大便、便血情况，做好记录。第5天眼球取血，置于EDTA管中，提取血清，于−20℃保存。取血后，立即剖腹取出肛门到盲肠末端段结肠，生理盐水冲洗干净后，测量所取结肠长度，称重，按要求分别保存结肠组织。此外，取出小鼠脾脏，称重后，于液氮中冻存。

2.6. 检测指标

HE染色按常规脱水，切片，制片，脱腊，HE染色，封片，于显微镜观察并拍照。

MPO测定按说明书方法步骤进行。

ELISA法测小鼠血清中IL-12，IL-23，IL-27，IL-35的表达水平，严格按照各试剂盒说明书方法步骤操作。

逆转录–聚合酶链反应(RT-PCR)测定相关因子用TRIzol二步法提取总RNA，按说明书进行逆转录反应合成cDNA.逆转录产物cDNA用于PCR扩增。严格按照PCR扩增试剂盒进行RT-PCR扩增。主要检测的因子有IL-27P28，IL-27EBI3，IL-12P35，IL-23P19以GAPDH为内参照，所设计的引物如表2。

Table 2. Primer design

表2. 引物设计

2.7. 数据统计分析

结果用软件SPSS19.0进行统计分析。计量资料以 $\bar{x}\pm s$ 表示，定量资料采用单因素方差分析；以P < 0.05为有统计学差异。

3. 结果

3.1. 各组小鼠一般状况

UC组、H组、L组小鼠造模期间出现扎堆、少动、少食、体重明显下降等表现；并在造模的第4天开始，小鼠出现稀便，肛门污秽、肛门带血等表现；第5天开始出现便血等情况。大便隐血实验阳性。给药后，H组小鼠体重稍有增加，血便情况逐渐好转。L组改善不明显。与NC组比较，UC组小鼠体重、结肠重量、结肠长度、脾脏重量明显降低，差异有统计学意义(P < 0.05)；与UC组比较，H组和L组体重、结肠重量、结肠长度、脾脏重量均增加，具有显著性差异(P < 0.05) (如表3)。

Table 3. Comparison of General Conditions of Mice ( $\bar{x}\pm s$ )

表3. 小鼠一般状况比较 ( $\bar{x}\pm s$ )

注：与NC组相比，^aP < 0.05；与UC组相比，^bP < 0.05。

3.2. 结肠组织病理学改变

1) DAI评分：与NC(0)组比较，UC组、H组、L组明显增高，差异有统计学意义(P < 0.05)；与UC (3.625 ± 0.076)组相比，H (1.917 ± 0.105)组、L (2.542 ± 0.061)组均升高(P < 0.05)。

2) MPO表达水平：与NC (6.17 ± 0.48)组比较，UC组(8.204 ± 0.79)，H (6.206 ± 0.92)组和L (6.421 ± 1.08)组明显增加，差异有统计学意义(P < 0.05)。与UC组比较，H组与L组表达明显降低，差异有统计学意义(P < 0.05)。

3) HE染色显微镜下观察：显微镜下可见NC组小肠黏膜形态完整，肠黏膜上皮完整、连续，刷状缘清晰可见，结构清楚，细胞形态无异常；UC组与NC组相比，小鼠肠黏膜上皮破坏严重，仅存少量腺体且结构排列紊乱，大量炎症细胞浸润，主要累及黏膜层和黏膜下层；H组也存在肠粘膜上皮的破坏，但较UC组其淋巴结增大不明显，仅见少量炎症细胞分布；L组结肠粘膜较UC组稍有好转(如图1)。

Figure 1. HE staining pathological changes observed

图1. HE染色病理改变所见(A图为正常组；B图为UC组；C图为高组；D图为低组)

3.3. ELISA检测小鼠血清IL-12、IL-23、IL-27、IL-35的表达

小鼠血清中IL-12和IL-23的表达：与NC组比较，UC组明显增高，差异有统计学意义(P < 0.05)，与UC组比较，H组和L组明显降低，差异有统计学意义(P < 0.05)；IL-27的表达：与NC组比较，UC组，稍有增高，差异有统计学意义(P < 0.05)，与UC组比较，H组和L组明显增高，差异有统计学意义(P < 0.05)；IL-35的表达：与NC组比较，UC组明显降低，差异有统计学意义(P < 0.05)，与UC组比较，H组和L组明显增高，差异有统计学意义(P < 0.05) (如表4)。

3.4. RT-PCR检测小鼠结肠组织IL-27P28，IL-27EBI3，IL-12P35，IL-23P19的mRNA相对含量的表达

小鼠结肠组织中IL-27P28和IL-27EBI3的mRNA相对含量：与UC组比较，H组，L组明显增高，差异有统计学意义(P < 0.05)；IL-12P35与IL-23P19的mRNA相对含量与UC组比较，H组，L组明显降低，差异有统计学意义(P < 0.05) (如表5)。

Table 4. Comparison of serum IL-12, IL-23, IL-27, and IL-35 in each group of mice ( $\bar{x}\pm s$ )

表4. 各组小鼠血清IL-12、IL-23、IL-27和IL-35比较( $\bar{x}\pm s$ )

注：与NC组相比，^aP < 0.05；与UC组相比，^bP < 0.05。

Table 5. Comparison of mRNA relative contents of IL-27P28, IL-27EBI3, IL-12P35, and IL-23P19 in mouse colon tissue ( $\bar{x}\pm s$ )

表5. 小鼠结肠组织中IL-27P28, IL-27EBI3, IL-12P35, IL-23P19的mRNA相对含量比较( $\bar{x}\pm s$ )

注：与UC组相比，^aP < 0.05。

4. 讨论

UC是一类反复发作的，弥漫性的炎症。近年来在我国报告的病例不断增加，且其有可能导致癌变 [8] 。UC发病机制还不清楚，有研究认为Thl和Th2细胞亚群失衡在UC的发生发展中起主导作用 [9] 。也有研究显示：细胞亚群及其产生的细胞因子间平衡紊乱在UC的发生发展中起重要的作用 [10] 。

DSS诱导的UC模型是目前研究UC动物模型的经典方法之一。该模型简单易操作，重复性好，其临床症状及结肠病理变化符合人类UC特点。本实验通过饮用DSS造模，自由饮用3.5% DSS3天后，小鼠出现饮食和体重剧减、懒动等，第4天小鼠出现腹泻、血便等。取材时，发现UC模型小鼠体重，结肠重量，脾脏重量等明显减轻，结肠长度明显缩短。将小鼠结肠沿纵轴剪开肉眼观察：UC组小鼠结肠黏膜有大片充血水肿灶，并伴有多处糜烂、溃疡形成；病理切片显微镜下观察：UC组小鼠结肠粘膜出现大片坏死，形成溃疡，各层次结构混乱不清，黏膜及黏膜下层大量炎细胞浸润，间质充血水肿，粘膜厚度变厚；此外，UC组小鼠DAI评分明显增高，MPO活性明显增高等，这些都与前人研究的DSS诱导的UC小鼠模型一致。由此说明小鼠UC模型是成功的。

IL-27 (InterleukinL-27)是IL-12家族成员之一，IL-12家族除了IL-27之外，还包括IL-12、IL-23、IL-35。IL-12是一种促炎性细胞因子，在诱导初始CD4+T细胞向Thl分化并促进Thl产生IFNγ中起关键作用。有研究显示在白塞病 [11] 、炎症性肠病 [12] 中，IL-12的表达明显升高；IL-23作为一种免疫调节细胞因子，其主要的生物作用是促进细胞免疫，近年来的研究揭示IL-23在多发性硬化症的病理过程中发挥重要作用 [13] ；在克罗恩病 [14] 中，其表达也是增高的；有人研究IL-35在胶原诱导的关节炎模型中的表达，证实注射IL-35后小鼠关节炎的发生率显著降低，这表明IL-35是一种抑制炎症的细胞因子 [15] 。本研究显示，UC与NC比较，IL-12、IL-23的表达水平均上调，而IL-35的表达水平有所减低；IL-27治疗后，IL-12，IL-23的表达明显降低，而IL-35的表达升高，所以IL-27对UC的防护作用可能是通过影响IL-12家族成员的表达实现的。

总之，本研究通过IL-27皮下注射干预实验性结肠炎小鼠，发现IL-27能够通过调节IL-12家族成员的表达抑制结肠炎的炎症反应。因此，IL-27对小鼠UC的防护作用可能是通过上调IL-27，IL-35，下调IL-12，IL-23实现的。这为UC治疗提供了新思路。

参考文献