1. 引言
红茶作为一种全发酵茶，具有产量高、消费广和国际贸易量大等特点 [1] 。红茶含有多种功能性活性成分，具有抗氧化、抗癌、防治心血管疾病和抗炎等生理功能 [2] 。万源市地处大巴山腹地，属于全国三大富硒区之一，是四川唯一的天然富硒区。富硒名优产品众多，其中富硒茶叶作为万源四大富硒产业之一。万源富硒茶茶叶嫩度好，茸毛多，芽叶内含物积累高 [3] 。
目前红茶主要集中于加工工艺和风味差异性研究，而万源富硒红茶化学成分的研究未见报道 [4] [5] [6] 。茶多酚是多羟基酚类化合物的复合物，由30种以上的酚类物质组成，其主要成分是儿茶素及其衍生物，是茶叶中产生保健功能的主要化学成分 [7] 。近年来，关于茶多酚有许多提取方法及其抗氧化活性研究，研究人员已对日照绿茶、黑茶及信阳毛尖茶的提取工艺进行优化 [8] [9] [10] 。由于茶叶的不同，其提取的最佳条件都不尽相同 [11] 。因此，本论文研究万源富硒红茶中茶多酚的超声波乙醇辅助提取法的工艺优化，为万源富硒红茶在食品、医药的开发中提供理论基础。
2. 材料与方法
2.1. 原料
四川省万源市固军精制茶场富硒红茶。
2.2. 主要试剂
福林酚、PBS缓冲液(生化试剂，飞净生物科技有限公司)；无水碳酸钠、95%乙醇、无水乙醇、30%过氧化氢、水杨酸、抗坏血酸(分析纯，成都市科隆化学品有限公司)；没食子酸、七水合硫酸亚铁、DPPH (上海麦克林生化科技有限公司)；ABTS+、过硫酸钾(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。
2.3. 主要仪器
Heraeus Megafuge 8R高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Varioskan LUX多功能酶标仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，河南予华仪器有限公司；MFJ-W317粉碎机，北京利仁科技有限责任公司。
2.4. 试验方法
2.4.1. 茶多酚标准曲线
以没食子酸为标准品，参考张秀芬等 [12] 的测定方法绘制没食子酸标准曲线。通过拟合所得线性回归方程为
，R2 = 0.9978，表明标准曲线具有良好的线性关系。
2.4.2. 茶多酚提取率的测定
称取0.5 ± 0.001 g茶叶粉末样品于锥形瓶中，按一定液料比加入乙醇，封口后在一定的超声温度下，处理一定的时间，3000 r/min离心10 min，取上清液定容至25 mL，得到提取物母液，取1 mL提取物母液定容至100 mL，得到样品待测液。每个实验重复三次，茶多酚的提取率见式(1)：
(1)
式中：c为提取液中茶多酚的浓度，μg/mL；
V为茶多酚提取液母液体积，mL；
n为稀释倍数；
m为茶粉质量，g。
2.4.3. 茶多酚提取的单因素试验
以茶多酚提取率为评价指标，通过单因素实验探究各因素对茶多酚提取率的影响。准确称取0.5±0.001 g万源富硒红茶，在超声功率为360 W下，对不同乙醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%)、液料比(10:1、15:1、20:1、25:1、30:1 mL/g)、超声时间(20、30、40、50、60 min)、超声温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)进行考察，研究其对茶多酚提取率的影响。
2.4.4. 响应面试验优化茶多酚提取工艺
在单因素实验的基础上，选取对茶多酚提取率影响较大的因素，根据Box-Behnken设计原理，以茶多酚提取率为响应值，分析三因素之间的相互作用，优化万源富硒红茶茶多酚的提取工艺，试验因素及水平见表1。
Table 1. Response surface test factors and levels
表1. 响应面试验因素及水平
2.5. 数据分析
所有实验数据重复三次，数据记录的方式为平均值±标准差。利用SPSS Statistics 27.0分析实验数据，采用单因素(ANOVA)检验法，分析单因素显著性差异。利用Design-Expert 11分析实验数据，采用Box-Behnken响应面试验法，对万源富硒红茶茶多酚的提取工艺进行优化。利用Origin 2021绘图。
3. 结果与分析
3.1. 单因素试验
3.1.1. 乙醇浓度对茶多酚提取率的影响
不同的乙醇浓度对茶多酚提取率影响如图1所示。由图1可知，随着乙醇浓度的增加，茶多酚提取率在乙醇浓度为30%~40%时缓慢增加，且当乙醇浓度为40%时，提取率最大为13.70%，显著高于其他乙醇浓度(P < 0.05)。在乙醇浓度为40%~70%时，茶多酚提取率有所下降，原因可能是由于随着乙醇浓度的不断增加，使杂质溶出度增加，导致茶多酚的提取率降低。所以，最佳的乙醇浓度为40%。
Figure 1. The effect of ethanol concentration on the extraction rate of tea polyphenols
图1. 乙醇浓度对茶多酚提取率的影响
3.1.2. 超声温度对茶多酚提取率的影响
不同的温度对茶多酚提取率影响如图2所示。由图2可知，温度对茶多酚提取率的影响具有双重效应，随着超声温度的升高，茶多酚的提取率在超声温度为30℃~60℃时逐渐增加，且当超声温度为60℃时，提取率最大为14.53%，显著高于其他超声温度(P < 0.05)。在超声温度为60℃~70℃时，茶多酚提取率有所下降，原因可能是由于高于最适温度后，高温使杂质溶出，杂质与多酚类物质与乙醇分子竞争性结合，从而导致提取率降低。所以，最佳的超声温度为60℃。
3.1.3. 液料比对茶多酚提取率的影响
不同的液料比对茶多酚提取率影响如图3所示。由图3可知，随着液料比的增加，茶多酚提取率在液料比为10:1~25:1 mL/g时逐渐增加，且当液料比为25:1 mL/g时，提取率最大为10.47%，显著高于除30:1 mL/g以外的液料比(P < 0.05)。在液料比为25:1~30:1 mL/g时，茶多酚提取率有所下降，原因可能是由于随着乙醇溶液的增加，提取率不断增加，达到饱和时，乙醇溶液的增加对提取率的影响程度会减弱。所以，最佳的液料比为25:1 mL/g。
Figure 2. The effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of tea polyphenols
图2. 超声温度对茶多酚提取率的影响
Figure 3. The effect of liquid-material ratio on the extraction rate of tea polyphenols
图3. 液料比对茶多酚提取率的影响
3.1.4. 超声时间对茶多酚提取率的影响
不同的超声时间对茶多酚提取率的影响如图4所示。由图4可知，随着超声时间的增加，茶多酚的提取率在超声时间为20~50 min时逐渐增加，且当超声时间为50 min时，提取率最大为12.06%，显著高于除40 min以外的超声时间(P < 0.05)。在超声时间为50~60 min时，茶多酚提取率有所下降，原因可能是由于提取后期醇溶性杂质也被提取出来，从而导致提取率的降低。所以，最佳的超声时间为50 min。
Figure 4. The effect of ultrasonic time on the extraction rate of tea polyphenols
图4. 超声时间对茶多酚提取率的影响
3.2. 响应面试验的优化
3.2.1. 响应面试验
根据对单因素试验的分析，采用Box-Behnken响应面试验法研究乙醇浓度、超声时间、超声温度三个因素之间的相互关系，并使用Design-Expert 11软件进行数据处理，进行茶多酚提取工艺优化，响应面试验设计方案及结果见表2。
Table 2. Response surface test design scheme and results
表2. 响应面试验设计方案及结果
3.2.2. 方差分析
使用Design-Expert.V11.1.0.1软件分析表2中的数据，得到茶多酚提取率(Y)对自变量乙醇浓度(A)、超声温度(B)、超声时间(C)的回归方程：
。通过回归模型方差分析检验方程的有效性。
Table 3. ANOVA for the regression model
表3. 回归模型的方差分析
注：***差异极显著(P < 0.001)；**差异较显著(P < 0.01)；*差异显著(P < 0.05)。
Table 4. Equation correlation coefficients
表4. 方程相关系数
由表3可知，模型的P < 0.0001，表明此模型极具显著性。失拟项P > 0.05，表明模型相对误差小。由表4可知，模型的R2 (决定系数)、Adjusted R2(校正决定系数)、C.V.% (变异系数)分别为0.9952、0.9891、2.32%，说明模型的重复性和拟合性较好。所以，此模型可靠，可用于分析预测。其中，乙醇浓度对提取率的影响极其显著(P < 0.001)，超声温度和超声时间对提取率的影响不显著(P > 0.05)。所以，对茶多酚提取率影响因子为乙醇浓度 > 超声时间 > 超声温度。
3.2.3. 响应面交互作用
等高线图和响应面曲面图能够预测和检验响应值与自变量之间的关系。由图5可知，AB、AC、BC的等高线图都近似圆形，说明两者交互作用对万源富硒红茶茶多酚的提取率的影响均不显著(P > 0.05)。
(a) 超声温度和乙醇浓度的交互作用 
(b) 超声时间和乙醇浓度的交互作用
(c) 超声时间和超声温度的交互作用
Figure 5. The contour line and response surface plot of the interaction of each factor
图5. 各因素交互作用的等高线和响应面图
3.2.4. 提取工艺优化及验证实验
通过响应面试验得出最佳条件为：乙醇浓度40.99%，超声温度60.19℃，超声时间49.64 min。所以，考虑实验的经济性与可行性，最佳工艺条件调整为：乙醇浓度41%，液料比25:1 mL/g，超声温度60℃，超声时间50 min，超声功率360 W，此时的提取率可以达到16.28%。在此最佳工艺条件下进行了验证实验，茶多酚的提取率为16.12%，与预测值的偏差为0.16%，表明该模型能够很好地预测实际提取率，具有可行性。
4. 结论
1) 以万源富硒红茶为原料，研究了乙醇浓度、液料比、超声温度、超声时间对茶多酚提取率的影响。
2) 在单因素试验基础上，利用响应面分析法优化了万源富硒红茶中茶多酚的提取工艺条件，最佳工艺条件：乙醇浓度41%，液料比25:1 mL/g，超声温度60℃，超声时间50 min，此时的茶多酚提取率可以达到最大值为16.12%，研究显示百色红茶在最佳工艺条件下多酚提取率仅为5.51% [13] ，可见采用该工艺，能够有效提取万源红茶中茶多酚，为万源红茶的进一步推广提供理论依据。
基金项目
达州市科技计划项目(21ZDYF0022)，特色植物开发研究四川省高校重点实验室项目(TSZW2101)。
参考文献
NOTES
*通讯作者。