响应曲面法优化五味子多糖的热水提取工艺

Optimization of Hot Water Extraction Process for Polysaccharides from Schisandra chinensis Using Response Surface Methodology

摘要: 本研究以干燥的五味子果实为材料，通过单因素试验、Box-Behnken中心组合试验和响应面分析法，对热水浸提法提取五味子多糖的工艺进行了系统研究。我们重点考察了料液比、提取时间、提取温度和提取溶剂pH值对五味子多糖提取得率的影响，并确定了最佳的提取工艺条件为料液比为1:30 (g/mL)，提取温度90℃，提取时间160 min，提取溶剂pH值为7。在这些最优工艺条件下，五味子多糖的提取得率达到了6.94%，提取效率较高。

Abstract: This study investigated the extraction process of polysaccharides from dried Schisandra chinensis fruits using single-factor experiments, Box-Behnken central composite experiments, and response surface analysis. We focused on examining the effects of liquid-to-material ratio, extraction time, extraction temperature, and solvent pH on the extraction rate of polysaccharides from Schisandra chinensis. The optimal extraction conditions were determined to be a liquid-to-material ratio of 1:30 (g/mL), an extraction temperature of 90˚C, an extraction time of 160 minutes, and a solvent pH of 7. Under these optimal conditions, the extraction rate of polysaccharides from Schisandra chinensis reached 6.94%, indicating a high extraction efficiency.

1. 引言

多糖是一类糖类物质，其分子结构复杂，主要存在于动物细胞膜、植物和微生物的细胞壁中，是生命构成的重要组成物之一 [1] 。多糖具有多种生物活性功能，包括抗氧化、抗炎、免疫调节、抗肿瘤等 [2] ，因此具有极高的药用价值。由于多糖生物活性功能丰富多样，对维护人体健康和预防疾病具有重要作用，因此在医药和保健领域具有广泛的应用前景。

五味子是中国传统的药食同源植物，属于木兰科植物，一般指北五味子(Schisandra chinensis (Turcz.) Baill)。它的干燥成熟果实被广泛用于药用和食用。根据《中华人民共和国药典》(2020版)的记载，五味子具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心等功效，可用于治疗久嗽虚喘、梦遗滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗盗汗、津伤口渴、内热消渴、心悸失眠等病症。

五味子富含蛋白质、脂质、维生素C等营养物质，同时还含有多糖、木脂素、挥发油、多酚等活性物质。现代药理学研究表明，五味子具有抗氧化、抗炎、保肝、镇静、抗衰老等功效，其中多糖作为五味子的重要成分之一 [3] ，因其特殊的结构以及丰富的生物活性和保健作用而备受研究者青睐 [4] 。五味子多糖具有显著的抗氧化 [5] 、免疫调节 [6] 、抗肿瘤 [7] 、保肝 [8] 、降血糖 [9] 、降血脂 [10] 、神经保护 [11] 、心脏保护 [12] 等生物活性。目前，五味子多糖的主要提取方法包括热水浸提法 [13] 、酶辅助提取法 [14] 、超声辅助提取法 [9] 、微波辅助提取法 [15] 及双水相萃取法 [16] 等。

热水提取法是从传统草药中提取多糖的经典方法 [17] ，该法具有操作简单、使用范围广、经济环保，适用于工厂化生产等优点，其重要影响因素包括料液比、提取温度、提取次数和提取时间等 [18] 。本研究以干燥的五味子果实为材料，通过单因素试验、Box-Behnken中心组合试验和响应面分析法，对热水提取五味子多糖的工艺进行了系统研究，优化了五味子中多糖的提取工艺条件。这些研究成果对于五味子多糖的工厂化生产工艺具有一定的参考价值。

2. 实验材料与研究方法

2.1. 实验仪器与实验材料

2.1.1. 实验仪器

UV-124型紫外分光光度计(日本岛津公司)、RE2000A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)、DF-101B集热式恒温搅拌器(金坛市国旺实验仪器厂)、750T粉碎机(铂欧五金厂)。

2.1.2. 实验材料

五味子干果(产自辽宁)，无水乙醇，苯酚、浓硫酸、Na₂CO₃、葡萄糖等均为国药的分析纯试剂。

2.2. 实验方法

2.2.1. 五味子多糖提取工艺

五味子干果→烘干→粉碎→加入圆底烧瓶中→加入适量的提取溶剂→加热提取一定时间→过滤取滤液并用少量蒸馏水润洗残渣合并滤液→旋转蒸发仪中浓缩至相同体积→加入4倍体积的无水乙醇→静置过夜→离心取沉淀→溶解于相同体积的水中并稀释到合适的浓度→硫酸苯酚法显色→可见分光光度计测量→计算多糖提取得率。

2.2.2. 提取单因素试验

研究中我们选择了料液比、提取时间、提取温度和溶剂pH这四个对多糖提取得率影响较大的因素进行单因素试验。实验中，我们在保持其他因素不变的条件下，分别考察每个因素对多糖提取得率的影响。

我们采用硫酸苯酚法 [19] 测定多糖含量，以葡萄糖作为标准品。计算总多糖提取率的公式为：

$多糖提取得率=\frac{\left(C\times V\times D\right)}{W}\times 100\%$

在公式中，C表示测得的样品中多糖的浓度(以葡萄糖计，单位为g/mL)，D表示样品溶液的综合稀释倍数，V表示提取液的总体积(单位为mL)，W表示提取中所用五味子的质量(单位为g)。

3. 研究结果与讨论

3.1. 单因素试验

3.1.1. 料液比对五味子多糖得率的影响

Figure 1. The effect of the material-liquid ratio on the yield of polysaccharides from Schisandra chinensis

图1. 料液比对五味子多糖得率的影响

在圆底烧瓶中加入5克五味子粉末，随后采用不同的料液比例(1:15、1:20、1:25、1:30、1:35)进行提取实验。保持其他条件恒定不变：pH值维持在7.0，提取温度为80℃，提取时间为160 min。根据2.2.2中所述的实验程序，测定吸光度并计算总多糖的提取率。实验结果见图1。根据图表数据，我们可以观察到在料液比为1:30时，五味子多糖的提取率达到了最高值，为6.80%。我们推测这可能是由于溶剂量较少，导致样品不能完全溶解，进而使得多糖的提取率相对较低。随着料液比例的增加，多糖的提取率也逐渐提高，但在达到1:30后几乎不再显著增加，甚至在本实验中出现了轻微下降。此外，料液比例也应适度，过高会增加溶剂的使用和能耗，并且会对后续的浓缩等工序造成困难。

3.1.2. 提取时间对五味子多糖得率的影响

称取5 g五味子粉末，放入圆底烧瓶中。在固定条件下，即料液比为1:30，pH值为7.0，进行不同处理时间(40、80、120、160、200 min)的提取实验。测定各组的吸光度，并计算总多糖的提取率。实验结果如图2所示。

Figure 2. The effect of extraction time on the yield of polysaccharides from Schisandra chinensis

图2. 提取时间对五味子多糖得率的影响

通过对图2的观察，我们可以发现，随着提取时间的增加，五味子中多糖的提取得率也逐步增加。在提取时间为160 min时，五味子中多糖的提取得率达到了最高值，为6.50%。然而，随着提取时间的继续增加，多糖的提取率反而开始略微下降。这可能是由于长时间的加热过程中，五味子多糖结构可能出现了少量的破坏的情况。同时，考虑到提取效率和能耗，实验中我们也不能一直增加提取时间。因此，提取时间160分钟左右是一个相对合适的选择，既可以获得较高的多糖提取率，又能有效控制实验所需的溶剂消耗和能源消耗。

3.1.3. 提取温度对五味子多糖得率的影响

在圆底烧瓶中加入5 g五味子粉末，随后采用不同的提取温度(60、70、80、90、100℃)进行提取实验。保持其他条件恒定不变：pH值维持在7.0，提取料液比为1:30。根据2.2.2中所述的实验程序，测定吸光度并计算总多糖的提取率。实验结果见图3。

Figure 3. The effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides from Schisandra chinensis

图3. 提取温度对五味子多糖得率的影响

从图3中可以知道：当提取温度达到90℃时，多糖得率最高，达到6.87%。当温度继续升高，可能是长时间的高温会导致部分多糖结构的破坏，从而导致实验测得的提取得率下降。

3.1.4. pH对五味子多糖得率的影响

Figure 4. The effect of pH on the yield of polysaccharides from Schisandra chinensis

图4. pH对五味子多糖得率的影响

将5 g五味子粉末加入圆底烧瓶中，接着使用不同pH值的水溶液(pH = 5、6、7、8、9)进行提取实验。其他条件保持不变：提取温度为90℃，提取料液比为1:30。按照2.2.2中描述的实验步骤，测定吸光度并计算总多糖的提取率。实验结果见图4。

从图4可以观察到，五味子多糖的提取率在初始阶段随着pH值的增加逐渐提高，达到pH = 7时达到最高值，为6.83%。然而，当pH值进一步增加时，多糖的提取率反而开始下降。这可能是由于五味子中的多糖主要以中性多糖为主，更容易溶解于接近中性的溶液中。

3.2. 响应面分析

3.2.1. 因素水平的选取

在单因素试验的基础上，进行中心组合试验(Box-Behnken设计)。选择料液比、pH值和提取温度这三个因素，探究它们对五味子多糖提取得率的影响。以五味子多糖的提取得率为指标，提取时间、提取温度、pH值为自变量。实验因素水平编码表如表1所示。

Table 1. Factors and levels of the response surface methodology

表1. 响应曲面法的因素和水平

3.2.2. 试验设计与结果

以三个因素和三个水平的17个测试点提取条件，设计了响应面，优化五味子多糖提取的条件，设计实验方案及各实验组的提取得率结果见表2。

Table 2. Box-Behnken experimental design scheme

表2. Box-Behnken设计实验方案

经过Design Expert 8.0软件对试验结果进行多元回归拟合，回归分析结果如表3所示。经回归方差分析显著性检验表明，该模型回归显著，并且该模型的R²值为0.9588，表明模型自变量与响应值之间存在着显著的线性关系。此外，该模型与实际试验数据的拟合程度较高，因此可以用于对五味子多糖提取试验进行理论预测。

Table 3. Regression analysis results for the yield of polysaccharides from Schisandra chinensis

表3. 五味子多糖得率的回归分析结果

注：^**表示P < 0.01时，差异极为显著；^*表示0.01 < P < 0.05时，差异显著

鉴于料液比、温度和pH这三个因素对多糖提取率的影响并非简单的线性关系，我们利用Design Expert 8.0统计软件对表2的数据进行了多元回归分析，以明确各因素对响应值Y的影响，得到回归方程

$\text{Y}=7.37-0.095\text{A}+0.27\text{B}+0.32\text{C}+0.61\text{AB}-0.25\text{AC}-0.23\text{BC}-1.56{\text{A}}^2-0.69{\text{B}}^2-1.18{\text{C}}^2$

通过表3中五味子多糖得率的回归模型方差分析表，我们可以得知二次项模型在本实验中具有显著性。回归方程中一次项A²、B²、C²对五味子多糖得率的影响极为显著，而一次项C和交互项AB对多糖得率的影响也比较显著，而其他项对多糖得率的影响则不显著。模型的相关性系数R² = 0.9588，表明该模型具有高度显著性。根据方差分析表中的交互项F值和P值，我们得知实验模型接近真实实验数据，没有太大差异，从而说明此实验模型具有较高的真实性和实践指导性。工艺条件对吸光值的影响大小顺序为：料液比(A) < 提取温度(B) < pH (C)。此模型的P值(0.0005)小于0.01，证明该模型能够较好地预测五味子多糖的最佳提取条件和多糖得率。

用Design Expert 8. 0将获得的二阶多项式方程转化为响应曲面图和等高线图(图5~图7)，进一步分析试验因素及水平对响应值的影响。通过响应曲面法的预测获得到的得率回归模型的分析，最佳提取五味子多糖的工艺条件如下：料液比为1 g:30.88 mL，提取温度为88.98℃，pH为7.06，预测最佳多糖得率为6.92%。

Figure 5. The interaction between material-liquid ratio and pH

图5. 料液比与pH的交互作用

Figure 6. The interaction between pH and temperature

图6. pH与提取温度的交互作用

Figure 7. The interaction between material-liquid ratio and temperature

图7. 料液比与提取温度的交互作用

3.3. 验证试验

根据软件预测结果，结合实际工艺设置的可行性，取pH为7，提取时间160 min，提取温度90℃，料液比1:30 (g/mL)为条件进行三次重复试验，平均多糖得率为6.94%，与模型预测结果接近，表明基于该响应面模型分析优化吸光值提取工艺的方法有效可行，实验表见表4。

Table 4. Yield of Schisandra polysaccharides under optimal extraction conditions

表4. 最优提取条件下五味子多糖的得率

4. 结论

通过单因素试验、中心组合试验以及响应面分析，我们研究了采用热水提取法提取五味子多糖的工艺，并确定了最优的提取工艺条件：料液比为1:30 (g/mL)，提取温度为90℃，提取时间为160分钟，提取溶剂的pH值为7。在这些最优工艺条件下，五味子多糖的提取得率达到了6.94%，提取效率较高。这种提取方法简单易行，提取溶剂价格相对较低，因此可以作为五味子中多糖提取的较优方法。这一研究结果为五味子中多糖成分的高效提取提供了较为可靠的工艺参考。

基金项目

国家级大学生创新创业训练计划项目(202211842044)，浙江省基础公益研究计划项目(TGY23B020001)。

NOTES

^*通讯作者。