摘要: 目的：采用网络药理学方法解析中药治疗冠心病的药理机制。方法：使用中药系统药理学分析平台(TCMSP)，检索丹参、檀香、砂仁、黄芪、人参、石菖蒲、薤白7味中药的有效成分和作用靶点。使用DDrugBank、TTD、In-Cardiome三个数据库中收集冠心病相关靶点。利用Cytoscape软件构建丹参、补心气口服液–冠心病靶点网络和靶点–通路网络。通过DAVID数据库进行生物功能和信号通路富集分析，预测丹参饮治疗冠心病的作用机制。结果：通过数据库筛选出得到丹参饮和补心气口服液作用的冠心病靶点，分别为68、97个，信号通路各10条，并利用分子对接技术筛选出前九个补心气口服液和丹参饮的成分与冠心病靶点对接的结合能排名。结论：丹参饮与补心气口服液可能通过多靶点、多信号通路协同治疗冠心病。
Abstract:
Objective: This paper aims to analyze the pharmacological mechanism of traditional Chinese medicine (TCM) in the treatment of coronary heart disease (CHD). Method: By using the TCM Systematic pharmacological analysis platform (TCMSP), this paper searches the effective components and targets of salvia miltiorrhiza, sandalwood, amomum, Astragalus, ginseng, Calamus, Allium Macrostemon 7. Three databases, DDrugBank, TTD and In-Cardiome, were used to collect CHD related targets. The target network and target pathway network of Salvia miltiorrhiza, and Buxinqi oral liquid were constructed by Cytoscape software. The biological function and signal pathway enrichment analysis were conducted through DAVID database to predict the mechanism of action of Danshen Decoction in the treatment of coronary heart disease. Results: 68 and 97 CHD targets of Danshen Decoction and Buxinqi oral liquid were selected through the database, and 10 signal pathways were obtained, and the binding energy ranking of the first nine Buxinqi oral liquid and Danshen decoction with CHD target was selected by molecular docking technology. Conclusion: Danshen Decoction and Buxinqi oral liquid may treat coronary heart disease through multi-target and multi-signal pathway synergism.
1. 引言
冠心病(Coronary Heart Disease, CHD)又称缺血性心脏病，是导致心脏发生炎性反应的最常见疾病，主要由冠状动脉粥样硬化使管腔狭窄、痉挛或阻塞导致心肌缺血、缺氧或坏死而引发 [1] ，占我国城乡居民总死亡原因的首位 [2] 。现代医学对冠心病的常用治疗手段主要分为手术治疗和药物治疗 [3] 。冠心病病理生理过程复杂，手术治疗后并发症多，西药靶点单一、作用局限，对该病难以起到全方位的干预作用。因此，寻找更为有效、便利、不良反应少的冠心病治疗方法具有重要意义。
中医根据疾病的部位、原因、性质，以及邪正关系，将其概括为某种性质的证，并根据结果对证用药，即“辨证论治”，利用中药多成分、多靶点的优势，从整体上对疾病的某种证型进行综合性的治疗，具有疗效显著、副作用少的特点。中医药在预防和治疗冠心病方面具有独特的理论和丰富的临床实践，临床疗效也已表明其在冠心病治疗具有重要意义。目前，冠心病主要分为8个证型，其中气虚血瘀型和心血瘀阻型为冠心病常见证型，丹参饮、补心气口服液分别为上述两种冠心病证型常用药 [4] 。由于当前中医证候原理不明确，中药成分复杂、作用机制不明确，影响了其更深入和灵活的应用和发展。本文旨在初步探究以上两种中药制剂对不同证型冠心病的分子机制，为冠心病的临床治疗提供新思路。
2. 方法
2.1. 利用网络药理学方法预测丹参饮和补心气口服液的靶点和作用通路
查阅资料得知，丹参饮由丹参、檀香、砂仁组成，补心气口服液的组成为黄芪、人参、石菖蒲、薤白。通过TCMSP数据库，分别查找两组中药的成分，以“OB值 > 30%，DL值 > 0.18”来筛选具有药用价值的成分，并收集它们的作用靶点。并从DrugBank、TTD、In-Cardiome三个数据库中收集冠心病相关靶点，与两组中药的分子靶点分别取交集，得到丹参饮和补心气口服液作用的冠心病靶点。将所得靶点各自导入DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp)并进行KEGG富集分析，得到两组中药各自作用的通路。
2.2. 构建“复方–中药–成分–靶点–通路”网络图
采用Cytoscapev3.6.1绘制两个复方的“复方–中药–成分–靶点–通路”网络图。利用Network Analyzer插件计算DTN中每个节点的网络性质，并筛选出在Degree、Betweenness Centrality (BC)、Closeness Centrality (CC)上，高于平均数的节点。
2.3. 利用分子对接技术验证中药成分和通路的相互作用
使用分子对接技术，将两组筛选出的关键成分与存在于通路中的关键靶点分别进行对接，计算成分和靶点之间的结合能。
3. 结果
3.1. 预测丹参饮和补心气口服液的作用靶点和通路
通过TCMSP数据库，以“OB值 > 30%，DL > 0.18”分别筛选出78、57个具有药用价值的成分，并收集它们的作用靶点。从DrugBank、TTD、In-Cardiome三个数据库中收集冠心病相关靶点，与两组中药的分子靶点分别取交集，得到丹参饮和补心气口服液作用的冠心病靶点，分别为68、97个。将所得靶点各自导入DAVID数据库并进行KEGG富集分析，得到两组中药各自作用的通路。由图2可知，丹参饮的信号通路包括癌症通路、神经营养因子信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、T细胞受体信号通路、Jak-STAT信号通路、PI3K-Akt信号通路等；补心气口服液的信号通路包括癌症通路、肿瘤坏死因子信号通路、PI3K-Akt信号通路、T细胞受体信号通路、NOD信号通路等(如图1)。
3.2. 构建并分析“复方–中药–成分–靶点–通路”网络图
采用Cytoscapev3.6.1绘制两个复方的“复方–中药–成分–靶点–通路”网络图，利用Network Analyzer插件计算网络中每个节点的性质，并筛选出在Degree、Betweenness Centrality (BC)、Closeness Centrality (CC)上，高于平均数的节点。结果发现，两组通路筛选结果都包含PI3K/Akt、cGMP/PKG、TNF信号通路(如图2)。
3.3. 利用分子对接技术验证中药成分和通路的相互作用
使用分子对接技术，将两组筛选出的关键成分与存在于通路中的关键靶点分别进行对接，结果(表1)显示两者皆结合良好。
4. 讨论
冠心病机制复杂，与之相关的通路较多。临床治疗冠心病利用中药多成分、多靶点的优势，从整体
Figure 1. The KEGG enrichment pathway maps of Danshenyin and Buxinqi Oral Liquid. The left figure represents Danshenyin, while the right figure represents Buxinqi Oral Liquid. The position on the horizontal axis indicates the fold enrichment of the pathway, the size represents the number of genes contained in the pathway (Count), and the color of the dots represents −log10 (P Value)
图1. 丹参饮和补心气口服液的KEGG富集通路图。左图为丹参饮，右图为补心气口服液。横轴位置表示通路富集倍数(Fold Enrichment)，大小表示通路所含基因个数(Count)，点的颜色表示−log10 (P Value)
Figure 2. The “Compound Prescription - Traditional Chinese Medicine - Ingredient - Target - Pathway” network diagrams for Danshenyin and Buxinqi Oral Liquid are presented below. Diagram (a) represents the network of Buxinqi Oral Liquid, with pink denoting targets, green indicating pathways, purple symbolizing ingredients, yellow representing traditional Chinese medicines, and red highlighting methods; Diagram (b), on the other hand, depicts the network of Danshenyin, where yellow marks targets, pink represents pathways, green identifies ingredients, purple signifies traditional Chinese medicines, and orange denotes compound prescriptions
图2. 丹参饮和补心气口服液的“复方–中药–成分–靶点–通路”网络图。(a) 为补心气口服液的网络图，粉色表示靶点，绿色表示通路，紫色表示成分，黄色表示中药，红色表示方法；(b) 为丹参饮的网络图，黄色表示靶点，粉色表示通路，绿色表示成分，紫色表示中药，橙色表示复方
Table 1. The top nine results for the binding energies of the interactions between the components of Buxinqi Oral Liquid and Danshenyin with targets associated with coronary heart disease
表1. 补心气口服液和丹参饮的成分与冠心病靶点对接的结合能排名前九的结果
上对疾病进行综合性的治疗，具有疗效显著、副作用少的特点。同时，中药多成分、多靶点的特点也与网络药理学的整体性、系统性等原则相契合 [5] 。尽管中医药在临床上的应用和疗效已经表明其在冠心病治疗中的重要意义，但由于中医证候原理不明确，中药成分复杂、作用机制不明确，影响了其更深入和灵活的应用和发展。探究中药“对证治疗”冠心病的生物学基础，不仅可以在临床用药方面提供参考，为新药设计与开发提供思路，还可以从药物治疗的角度探讨冠心病证型分型的生物学依据，在推动中医药与现代医学的结合上具有积极的作用。
现代药理学证明，通过抑制c-Fos和c-Jun相关基因的表达，能够阻碍AP-1的形成，从而抑制TNF-α所引起的内皮细胞凋亡和炎症反应，可能是治疗气虚血瘀型冠心病的一个重要途径。如Hou Jincai等人通过分析被治疗过的气虚血瘀型冠心病病人体内miRNA-gene网络，发现上调的miRNA-17-5p在气虚证型中具有重要的调节意义 [6] 。miRNA-17-5p能够靶向调控血管内皮细胞中FOSL1 mRNA从而抑制其基因的表达 [7] 。FOSL1，FOSL2，FOS和FOSB属于c-Fos基因家族，c-Fos和c-Jun共同组成AP-1复合物，Chen Tielong等人通过研究发现槲皮素可以通过下调AP-1，从而抑制TNF-α所引起的内皮细胞凋亡和炎症反应 [8] 。
同时，大量研究表明PI3K/Akt、cGMP/PKG、TNF信号通路在冠心病的发生发展过程具有重要意义。PI3K/Akt通路参与细胞凋亡与自噬、血管生成等过程，能够抑制冠状动脉粥样硬化以及改善心肌缺血等 [9] [10] [11] 。p53是体内关键的调控因子，常被缺氧、生长因子和DNA损伤等应激反应激活 [12] ，它引起的细胞自噬可进一步引起细胞凋亡 [13] ，Bcl-2、Bcl-xL 可阻止p53引起的细胞凋亡 [14] [15] 。Liu Chunping等人研究发现，丹蒌片通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路从而诱导巨噬细胞自噬，减少泡沫细胞的形成，阻碍动脉粥样硬化的形成 [16] 。有研究指出激活血栓中的p53可加速炎症介导的静脉血栓的血管重塑，从而增强血栓的溶解cGMP-PKG通路的激活可抑制Ca2+/CaMKII通路从而提高肌质网中钙离子含量，M. Elisa Lopes-Pires等人发现，PKC和AKT可上调cGMP/PKG信号通路，从而抑制ADP诱导的血小板聚集 [17] 。血小板活化后可通过PI3激酶促使GSK3α (Ser21)和GSK3β (Ser9)中N末端丝氨酸残基的磷酸化，抗磷酸化的GSK3α/β能够影响凝血酶、血小板功能 [18] 。TNF-α作为一种促炎细胞因子，可通过调节多种黏附因子的表达来促进炎症反应的发生 [19] 。Lutgens Esther等人通过实验研究证实，利用ILIB抗体来靶向治疗炎症，可有效改善心血管疾病 [20] 。杨健等人 [21] 结合网络药理学和机器学习研究中药治疗冠心病的作用机制，发现治疗心血瘀阻型的冠心II号方主要通过作用于VEGF通路来促进血管生成，治疗气虚血瘀型的八珍汤则特异性作用于TNF通路、NF-κB通路，与炎症反应关系密切。
本文选取两种常见冠心病证型——心血瘀阻型和气虚血瘀型以及对应代表中药复方——丹参饮和补心气口服液，通过挖掘TCMSP、DrugBank、TTD和In-Cardiome数据库，使用网络药理学方法对丹参饮和补心气口服液治疗冠心病的靶点、通路进行预测，发现两组通路筛选结果都为PI3K/Akt、cGMP/PKG、TNF信号通路，它们共同作用于c-Jun、TNF等18个共同靶点，但丹参饮有p53、GSK3B两个特异性靶点，补心气口服液有IL1B、FOS两个特异性靶点。笔者认为，丹参饮和补心气口服液可能都通过cGMP/PKG、PI3K/Akt、TNF信号通路共同治疗冠心病，但p53、GSK3B和FOS、IL1B可能是它们在靶点上调节“血瘀”和“气虚”的区别；并且由于两者在网络中筛选出的关键成分不一样，笔者认为，丹参饮和补心气口服液对于通路中共同靶点的作用强度可能具有差异。
总结以上，笔者提出这样的结论：丹参饮和补心气口服液治疗心血瘀阻型和气虚血瘀型冠心病的分子机制差异为，在PI3K/Akt、cGMP/PKG、TNF信号通路中存在特异性靶点和对共同靶点作用强度不同。以上推论可能对揭示两个复方中药调节心血瘀阻型和气虚血瘀型冠心病的分子机制差异具有一定作用，进而在指导临床灵活用药、开发新药以及探究冠心病证型分型的生物学依据方面具有一定意义。
基金项目
广州中医药大学大学生创新创业训练计划(项目编号：202210572208)。