1. 引言
活性氧(Reactive oxygen species, ROS)，如羟基自由基(HO∙)、过氧化物自由基(∙O22−)、单线态氧(1O2)和超氧化物自由基(O2−∙)，在生物过程中的稳态环境和细胞信号传导中起着至关重要的作用 [1] 。高浓度的ROS可通过诱导蛋白质、脂质、DNA的氧化损伤和造成细胞代谢过程中的功能障碍进而导致细胞死亡。基于ROS的抗癌治疗已被广泛研究，其治疗疗效主要依赖于肿瘤部位的氧浓度水平 [2] 。许多文献已经证实，乏氧的肿瘤微环境对癌细胞化疗和依赖氧的光动力治疗具有极大限制作用 [3] [4] [5] 。因此，开发新型高效的治疗方案来克服肿瘤缺氧微环境，不仅要增强纳米材料生物相容性，还要使纳米材料能在外界刺激下有效分解并产生非依赖氧的高毒性的活性氧，进而提高肿瘤治疗效果。
2,2'-偶氮双[2-(2-咪氮啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(AIPH)作为一种偶氮化合物，不仅具有良好的水溶性，也能在光照或热刺激下通过自身的迅速分解并产生烷基自由基 [6] ，这是一种不依赖于氧的自由基的产生方式。AIPH所产生的自由基不仅对细胞有毒，也可氧化细胞元素或与氧气相互反应，产生有毒物质。即使在缺氧肿瘤微环境中，AIPH仍能产生自由基，增加细胞内过氧化物含量，进一步触发肿瘤细胞凋亡。然而，AIPH在化学上不稳定，容易在体内分解。因此，如何提高肿瘤部位AIPH的可用性，以及减少毒副作用是不可避免的问题 [7] [8] [9] [10] 。基于此，在本文中，我们利用mPDA的多孔结构去负载AIPH制备纳米治疗剂(mPDA@AIPH) (见示意图1)。mPDA@AIPH作为一个药物载体，通过细胞的胞吞作用进入肿瘤细胞内。在近红外光照下，利用mPDA的光热效应产生的热量促进AIPH分解产生烷基自由基，进而通过自由基与光热治疗来协同增强抗肿瘤治疗效果。
Figure 1. Schematic illustration of the synthetic procedure of mPDA@AIPH nanoparticle
图1. mPDA@AIPH纳米粒子合成示意图
2. 实验部分
2.1. 仪器与试剂
扫描电子显微镜(ZEISS Gemini SEM 300)；透射电子显微镜(Talos F200X)；红外热成像相机(Fotric 220)；共聚焦激光扫描显微镜(Leica TCS SP8)；紫外–可见吸收光谱(UV-Vis)；傅立叶转换红外光谱仪(FTIR)；Zeta电位仪(LA-960)；酶标仪(Multiskan FC)；纳米激光粒径分析仪(马尔文ZEN360)。
盐酸多巴胺，聚醚F127，氨水，无水乙醇，2,2-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(AIPH)，2,2'-叠氮–双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) (ABTS)，亚甲基蓝(MB)，四甲基联苯胺(TMB)，二甲基亚砜(DMSO)，青霉素–链霉素溶液(100X)，2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)，噻唑蓝(MTT)，Hoechst 33342细胞染色液，线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)，无水乙醇等均为分析纯购买自上海阿拉丁试剂有限公司；实验所用均为去离子水。
2.2. 介孔聚多巴胺(mPDA)纳米颗粒的合成
0.15 g盐酸多巴胺和0.1g F127加入到混合溶液中，其中混合溶液为5 mL去离子水和5 mL无水乙醇的混合溶液，在1000 rpm的转速下搅拌加入160 μg均三甲苯，在150 W的功率下超声5 min；随后，375 μL的氨水滴入溶液中，在1000 rpm转速下搅拌2 h。反应结束后，以10,000 rpm的转速离心10 min，用乙醇和水洗涤反应物，最后冷冻干燥保存材料。
2.3. mPDA@AIPH纳米治疗剂的合成
将合成的mPDA分散在5 mL的去离子水中，并在超声作用下完全分散。然后，加入50 mg的AIPH，在黑暗中搅拌48 h。解决方案是12000 rpm离心10 min，得到的mPDA@AIPH，再用去离子水洗涤3次，去除未反应的AIPH，使用前保存在4℃保存。
2.4. mPDA@AIPH光热转换性能测试
配置100 μg/mL mPDA@AIPH用808 nm近红外激光照射，选取不同的功率(0.25 W/cm2、0.6W/cm2，0.8 W/cm2、1.0 W/cm2)，照射时间为10 min，数据每隔5 s实时记录一次，选取出最佳功率值。同时，配置不同浓度的mPDA@AIPH (100 μg/mL、300 μg/mL、500 μg/mL和600 μg/mL)作为光热性能测试组，以去离子水作为对照组，用808 nm近红外激光以功率为1.0 W/cm2的共照射10 min。并用红外热成像仪记录不同时间点纯水和mPDA@AIPH水溶液的温度变化情况。为了进一步研究mPDA@AIPH的光热效应稳定性，选取浓度为100 μg/mL的mPDA@AIPH溶液，用808 nm近红外激光器激发，功率为1.0 W/cm2，每次照射10 min停止照射并让溶液自然冷却。一共进行六次开/关循环照射，每隔5 s采集一次温度数据。
2.5. AIPH的释放
使用标准曲线测量法检测溶液中AIPH的含量，AIPH在360 nm有紫外吸收峰，因此可以用紫外分光光度计测量绘制释放曲线。
AIPH标准曲线：配置3 mL pH = 4.5的磷酸盐缓冲溶液，加入不同浓度的AIPH水溶液(0.5 mg/mL、1 mg/mL、1.25 mg/mL、2 mg/mL、2.5 mg/mL、4.0 mg/mL、5.0 mg/mL和8.0 mg/mL)，将待测溶液放置仪器内进行测量，绘制不同AIPH浓度变化曲线。
不同功率下AIPH的释放：配置3 mL pH = 4.5的磷酸盐缓冲溶液，溶液中加入mPDA@AIPH (1.0 mg/mL)，ABTS (1.0 mg/mL)，使用808 nm的激光仪以不同的功率(0、0.2、0.5、1.0 W/cm2)持续对待测溶液进行照射，并每隔5 min测量一次，一共20 min。
2.6. 细胞活性试验
将HeLa以1 × 104个/孔的细胞密度培养在96孔板中，每孔板均含有200 µL新鲜培养液，共培养6个96孔板。将铺设完的96孔板置于细胞培养箱(参数：37℃、5% CO2)静置8 h，待细胞完全贴壁后，更换培养液。其中三板，留两排作为对照组，其余分别加入每孔加入50 µL含有不同浓度的mPDA、AIPH和mPDA@AIPH (10、20、40、80、160 µg/mL)的培养基，加药完毕继续置于培养箱培养4 h后，避光拿出，用808 nm激光器以1.0 W/cm2给每个孔照射5 min。完毕后继续放入培养箱孵育16 h。另外三板不用激光，铺板浓度以及规则与上述相同，孵育48 h。孵育结束后用PBS洗涤两遍，加入10 µL预先配置好的MTT (1.0 mg/mL)，避光孵育4 h，吸取含MTT溶液并加入150 µL的DMSO，放置在微孔板振荡器上，避光振荡10 min，使甲瓒充分均匀混合。用酶标仪测定吸光度，以对照组的细胞活性100%来计算各浓度的细胞存活率。每次实验重复三组，取平均值。
3. 结果与讨论
3.1. 材料表征
首先对合成的mPDA的形貌进行了SEM表征。如图2(a)所示，我们可以清晰看到mPDA表面的多孔结构，该纳米颗粒120 nm左右。我们分别对mPDA和mPDA@AIPH进行了粒径测试，从图2(b)中可以看出mPDA的尺寸大概120 nm，经过物理吸附AIPH后，纳米尺寸有所变大，mPDA@AIPH为130 nm左右。此外，我们通过mPDA、mPDA@AIPH的Zeta电位的变化去了解在合成过程中，表面电荷的变化。从图2(c)可以看到经过负载AIPH后，mPDA纳米粒子的表面负电荷由−12.5 mV变为−7 mV，这也间接证明了AIPH被成功负载在mPDA上。从图2(d)紫外可见光谱中，可以看到AIPH确实在360 nm处有吸收峰，同时我们负载过AIPH的mPDA也在同一位置出现吸收峰，这也进一步证明了AIPH被成功负载在mPDA上。
Figure 2. (a) SEM image of mPDA nanospheres; (b) Particle size distribution of mPDA@AIPH; (c) The Zeta potentiogram of mPDA and mPDA@AIPH; (d) UV-Vis spectrum of mPDA, AIPH and mPDA@AIPH
图2. (a) mPDA的扫描电镜图；(b) mPDA、mPDA@AIPH的粒径分布图；(c) mPDA、mPDA@AIPH的Zeta电位图；(d) mPDA、AIPH、mPDA@AIPH的紫外谱图
为了进一步确定AIPH被成功负载，我们对mPDA、AIPH、mPDA@AIPH这三个材料又进行了红外光谱测试。如图3中所示，通过三个光谱的对比，发现mPDA@AIPH有一段只属于AIPH的吸收带，图中橙色区域，在2828~2982 cm−1的吸收带是−CH2的拉伸振动峰，在1680~1690 cm−1处是C-O拉伸振动峰值 [11] 。这些结果均表明了AIPH可以通过物理吸附成功负载在mPDA纳米球上。
Figure 3. FTIR spectra of mPDA, AIPH and mPDA@AIPH
图3. mPDA、AIPH、mPDA@AIPH的红外谱图
3.2. AIPH释放测试
Figure 4. (a) UV-vis spectra of AIPH with different concentrations; (b) AIPH release curves under 808 nm laser irradiation with different powers
图4. (a)不同浓度AIPH的紫外可见吸收光谱；(b)不同功率的808 nm激光照射下的AIPH的释放曲线
制作AIPH标准曲线如图4(a)，AIPH可以通过改变功率密度或激光照射的持续时间来控制AIPH释放。较高的激光功率密度从而产生较高的温度，所以在不同功率下AIPH释放曲线如图4(b)，从图中我们可以看到用808 nm激光器照射下，当照射功率为0.5和1.0 W/cm2时，累积从mPDA@AIPH中释放率可以达到45.0%和58.1%，这个时间段分别对应于平衡温度为47℃和58.8℃。在没有激光照射的情况下，仅仅只有4.3%左右的AIPH可以从mPDA@AIPH中被释放出来。通过这几组数据的对比分析说明，可以通过近红外激光控制AIPH的释放行为，进而热分解形成烷基自由基，达到光热和化学动力学协同治疗的目的。该纳米粒子的合成及治疗过程很大程度弥补了药物进入人体细胞内部不可控释放的缺点，为我们后续的体内外肿瘤治疗打下了良好的生物基础。
3.3. mPDA@AIPH纳米颗粒的光热性能研究
我们进一步对纳米治疗剂mPDA@AIPH的光热转换效果进行了测试，如图5中所示。用808 nm激光照射10 min后，浓度为600 μg/mL的mPDA@AIPH溶液温度从24.9℃提高到了55.2℃，而同样条件下纯水的温度几乎没有变化(图5(a))。此外，我们还通过改变激光功率强度来观察温度的升温情况(图5(b))，功率越大溶液的温度上升的也越快，将功率为1.0 W/cm2的与0.25 W/cm2的曲线对比，我们可以很明显发现相同浓度的溶液在不同功率的照射下能有21.3℃差别，说明溶液温度也对激光功率也有依赖性。此外，光热治疗剂最不可忽略的就是自身的光热稳定性，从图5(c)可以看出纳米治疗剂mPDA@AIPH在激光照射六次循环后溶液的温度上升没有明显差别，这表明mPDA@AIPH是一种很稳定的光热治疗剂。图5(d)为溶液的红外热成像图片，从图中可以看出，在808 nm激光照射下mPDA@AIPH溶液的红外热成像图片颜色变化非常明显，由刚开始的紫色最终变为深红色，表明温度升高非常快。而作为对照组的纯水则颜色变化不大。这些结果都表明，我们合成的纳米治疗剂mPDA@AIPH具有非常好的光热转换效果，可作为一种潜在的肿瘤光热治疗剂。
Figure 5. (a) Photothermal curves of mPDA@AIPH with different concentrations under 808 nm laser light (1.0 W/cm2); (b) mPDA@AIPH (500 μg/mL) photothermal curves at different power densities; (c) The heating curve of mPDA@AIPH aqueous solution during 6 on/off cycles under 808 nm laser (1.0 W/cm2) irradiation; (d) mPDA@AIPH Infrared thermal image corresponding to solution
图5. (a)在808 nm激光(1.0 W/cm2)光照下，不同浓度的mPDA@AIPH的光热曲线；(b) mPDA@AIPH (500 μg/mL)在不同功率密度下的光热曲线；(c) mPDA@AIPH水溶液在808 nm激光(1.0 W/cm2)照射下6次开/关循环的加热曲线；(d) mPDA@AIPH溶液对应的红外热图像
3.4. 体外肿瘤细胞ROS产生能力
为了检测纳米治疗剂mPDA@AIPH在肿瘤细胞内产生的活性氧，我们选用了活性氧荧光探针DCFH-DA对不同处理组的HeLa细胞进行荧光检测。从图6中可以看出，在没有激光照射下，AIPH、mPDA和mPDA@AIPH几乎看不见绿色荧光，这说明我们合成的mPDA本身无毒且不会产生ROS，也说明了在没有光热诱导下AIPH是无法进行分解从而产生有毒的羟基自由基，进一步说明mPDA@AIPH纳米药物的光可控性。在近红外激光照射下，AIPH开始产生微弱的荧光，这是因为激光照射下溶液的温度还是会有变化，导致部分AIPH开始热分解从而产生烷基自由基。但是细胞经过mPDA@AIPH产生了非常强烈的绿色荧光，这说明在激光的刺激下mPDA的光热效应使得微环境温度瞬间提高，且随着温度的上升AIPH分解的速率加快，有效地提高了细胞内烷基自由基的浓度。
Figure 6. Fluorescence images of HeLa cells stained with ROS fluorescence probe DCFH-DA under different treatments
图6. 不同实验组的ROS荧光探针DCFH-DA染色的HeLa细胞的荧光图片
3.5. 体外肿瘤细胞毒性实验
Figure 7. MTT assay for determining cytotoxicity of different treatments
图7. MTT方法测试不同实验组的细胞毒性
mPDA@AIPH抗癌效果不仅包括AIPH热分解形成的烷基自由基，还包括mPDA的光热治疗。因此，为了进一步测定mPDA@AIPH治疗效果，进行了体外肿瘤细胞活性实验。将HeLa细胞与不同浓度的AIPH、mPDA以及mPDA@AIPH进行培养，以对照组作为100%细胞活性，用MTT法测定计算细胞的相对活性。从图7中可以看出，在没有激光照射下，浓度10~160 μg/mL的范围内，mPDA纳米粒子表现出没有明显的毒性，即使在高浓度(160 μg/mL)下，其细胞活度仍然保持在90%以上。这说明mPDA是一种低毒的具有非常好的生物相容性的纳米药物载体。在外加808 nm激光照射下，AIPH显示出轻微的细胞毒性，这是因为激光的照射下导致AIPH部分被分解产生的烷基自由基诱导部分细胞凋亡。而mPDA组经激光照射后，细胞的存活率在60%左右，这说明mPDA在经过激光照射后充分发挥了光热治疗效果。其中，mPDA@AIPH显示出优异的细胞毒性，在浓度160 μg/mL下，激光照射后仅有15%左右的HeLa细胞存活，这说明结合光热–化学动力学这种联合治疗方式对肿瘤细胞治疗具有高效性。体外细胞实验结果表明，纳米治疗剂mPDA@AIPH具有作为抗肿瘤治疗剂的潜力。
4. 结论
在本文中，我们合成了多孔的mPDA纳米球作为载体负载一种自由基药物AIPH用于肿瘤光热与化学动力学联合治疗。实验结果表明，mPDA具有非常好的生物相容性和光热转换效果，在近红外光照下，可以通过局部升温来杀死肿瘤细胞，同时产生的光热还可以促进AIPH分解释放出高细胞毒性的烷基自由基。结合光热与自由基两者的协同作用，纳米治疗剂mPDA@AIPH显示出优异的抗肿瘤活性，在未来肿瘤临床治疗方面具有非常大的应用潜力。
基金项目
本项目由国家自然科学基金(批准号：22007052)，以及国家级大学生创新创业项目(202310304025Z)支持。
NOTES
*通讯作者。