基于叶绿体全基因组序列变异位点的葫芦科植物资源遗传多样性的分子鉴定新方法

A Novel Method for Molecular Identification of Genetic Diversity of Plant Resources in Cucurbitaceae Based on Taxon-Specific Variable Nucleotide Characters from Complete Chloroplast Genomes

摘要: 植物遗传多样性的精确鉴定是资源利用和相关产业发展的基础。我们利用来自葫芦科5个属(种和亚种)的叶绿体全基因组序列中的物种特有的4952个核苷酸变异位点作为分子性状编制分子鉴定检索表，供试样品得到成功鉴定。物种特有变异位点的数量和核苷酸构成存在属(种)间差异。马瓟瓜Cucumis melo subsp. agrestis (1753)和黑子南瓜Cucurbita ficifolia (1542)的特有变异位点的数量显著多于西瓜Citrullus lanatus (727)、藏瓜Indofevillea khasiana (623)和罗汉果Siraitia grosvenori (307)。罗汉果的特有变异位点的数量最少。马瓟瓜的特有变异位点中，T的比例(29.78%)均高于A、C或G (22.48%~24.30%)。黑子南瓜的特有变异位点中，A的比例(19.52%)低于T、C或G (24.97%~28.15%)。西瓜的特有变异位点中，A或T的比例(18.57%或21.46%)低于C或G (30.67%或29.30%)。藏瓜的特有变异位点中，T的比例(20.55%)低于A、C或G (25.04%~27.61%)。罗汉果的特有变异位点中，C的比例(21.82%)低于A、T或G (25.73%~26.71%)。结果显示，叶绿体基因组的单核苷酸变异位点信息，可用于葫芦科植物资源遗传多样性的分子鉴定。调查了中国过去120多年来葫芦科植物标本的收集现状，讨论了存在的问题与对策。本研究对于葫芦科植物种质资源的保护和利用以及相关产业的发展具有重要价值。

Abstract: Accurate identification of genetic diversity is essential for utilization of plant resources and development of the related industries. In this paper, 4952 taxon-specific variable nucleotide characters in the complete chloroplast genome of 5 species/subspecies from 5 genera in the Cucurbitaceae were used as molecular traits to identify the genetic resources of this plant family and to compile a molecular classification key for the first time. There are differences in aspects of amount and base composition of variable nucleotide characters among the species. The amount of taxon-specific variable nucleotide characters in Cucumis melo subsp. agrestis (1753) or Cucurbita ficifolia (1542) are significantly larger than those of Citrullus lanatus (727), Indofevillea khasiana (623) or Siraitia grosvenori (307). Siraitia grosvenori is the lowest in the amount of taxon-specific variable nucleotide characters. The proportion of T (29.78%) is higher than that of A, C or G (22.48%~24.30%) in Cucumis melo subsp. agrestis. The proportion of A (19.52%) is lower than that of T, C or G (24.97%~28.15%) in Cucurbita ficifolia. The proportion of A or T (18.57% or 21.46%) is lower than that of C or G (30.67% or 29.30%) in Citrullus lanatus. The proportion of T (20.55%) is lower than that of A, C or G (25.04%~27.61%) in Indofevillea khasiana. The proportion of C (21.82%) is lower than that of A, T or G (18.57%~21.46%) in Siraitia grosvenori. Our results indicated that taxon-specific variable nucleotide characters from the chloroplast genomes could be used for discrimination of different genera or species/subspecies in the Cucurbitaceae. The status of Cucurbitaceae plant specimens collected in the past over 120 years in China is investigated and problems and strategies have been discussed. This study is valuable for conservation and utilization of Cucurbitaceae plant germplasm resources and development of the related industries.

1. 引言

葫芦科(Cucurbitaceae)全球约有95属965种，为一年生或多年生藤本植物，少量种类为灌木或乔木，大多数自然分布于热带和亚热带，少数种类分布于温带地区。其中一些种类可食用(蔬菜或果品)、药用或观赏，例如，黄瓜Cucumis sativus L. (黄瓜属Cucumis L.)、南瓜Cucurbita moschata (Duchesne ex Lam.) Duchesne ex Poir. (南瓜属Cucurbita L.)、西瓜Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai (西瓜属Citrullus Schrad.)、香瓜Cucumis meloL. (又称甜瓜，为黄瓜属Cucumis的一年生匍匐或攀援草本植物)、罗汉果Siraitia grosvenorii (罗汉果属Siraitia Merr.)、苦瓜Momordica charantia L. (苦瓜属MomordicaL.)、匏瓜Lagenaria siceraria (Molina) Standl. (又称瓢葫芦或宝葫芦，为葫芦属Lagenaria Ser.的一年生攀援草本植物)等，已有7000多年的栽培和利用历史 [1] - [6] 。

葫芦科提供了大量蔬菜等重要经济植物，常采用嫁接方式进行人工栽培 [1] - [6] 。现代蔬菜嫁接研究1920年代兴起于日本等国。目前，中国的设施蔬菜栽培发达地区，西瓜、黄瓜、番茄Lycopersicon esculentum Mill. (茄科Solanaceae)等的嫁接苗比例在70%以上 [5] 。嫁接的目的是解决生产过程中出现的难题。嫁接是利用砧木的地下部(根系)的优良特性，达到抵抗逆境(低温、干旱、盐害、土壤传播的病害等)，或增加产量，或提高品质的效果 [2] - [9] 。品质主要指肉质粗细、风味、营养成分、商品外观等。例如，黄瓜作为接穗，嫁接到黑子南瓜Cucurbita ficifolia Bouché (南瓜属)的根系上，其作用机理是：1) 黑子南瓜的根系庞大，对土壤水分和养分的吸收能力强，有利于嫁接苗旺盛生长；2) 黑子南瓜的根系抗病性(主要指抗土壤传播的病害)和抗寒冷性强，黄瓜的自身根系无法与其相比。在反季节保护地(温室或大棚)栽培条件下，黄瓜通常生长在低温环境，因此，适应低温下生长的砧木(例如，黑子南瓜的根系)对黄瓜的产量增加具有重要的促进作用。黑子南瓜用作砧木时，对黄瓜果实的品质没有实质性影响。该嫁接技术已经广泛应用于黄瓜栽培 [2] - [9] 。蔬菜嫁接可以避免连续种植产生的连作障碍。连作障碍通常指蔬菜与土壤两个系统之间的诸多内部因素的综合作用，机理较为复杂。连作会增加作物代谢排出物的含量和有害微生物的数量，导致不利于作物在原地继续正常生长 [4] [5] [6] [9] 。

西瓜和甜瓜除了利用本属的植物作为砧木外，也采用同科(葫芦科)内的其它属的植物作为砧木。例如，西瓜嫁接采用的砧木有野生西瓜(Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai) (包括饲料用西瓜Citrullus amarus Schrad.)、瓠子(Benincasa hispida (Thunb.) Cogn.，又名瓠瓜，为葫芦科冬瓜属Benincasa Savi的一年生草质藤本植物)以及南瓜(包括印度南瓜Cucurbita pepo L.和中国南瓜Cucurbita moschata (Duchesne ex Lam.) Duchesne ex Poir.)。中国南瓜(也称番南瓜)原产地是亚洲南部和中南美洲。甜瓜主要用南瓜(印度南瓜或中国南瓜)做砧木，甜瓜的品质会受到一定的不良影响，如表面出现不同颜色的斑点，果肉变粗、风味变差等。市场上的西瓜和甜瓜存在品质较差的现象，是广泛关注的问题 [2] - [9] 。

从育种的角度有一些问题需要深入研究。例如，果肉纤维含量较高的西瓜，耐贮运性较好。从商业操作的角度看，是优点，但从消费者的角度看，口感不好，属于缺点。软肉的白兰瓜适口性好，但在运输过程中，成熟的白兰瓜容易被压扁。软肉品种在商业运输和销售过程中操作难度大。需要权衡考虑，结合采收策略设计育种方案 [2] - [9] 。

栽培方面，瓜类成熟前的提早采摘策略，便于运输，但降低了品质，特别是甜瓜。甜瓜果肉的含糖量是衡量品质的重要指标，甜瓜果实糖分的积累阶段主要在果实成熟的后期，因此，提早采收对果实含糖量影响很大。商品甜瓜往往需要远距离运输，还需要经过一段时间才能卖出去。甜瓜的成熟果实的贮运性较差，货架期较短。因此，提高贮运性是商品甜瓜选育的重要目标之一。在生产上，提高贮运性最直接、简单的常用办法是提前采收，代价是会牺牲一些品质。甜瓜产区经常能够吃到品质非常好的产品，但产区以外的商场很难买到品质非常好的产品，原因就在于此。此外，栽培中常用的肥料是化肥，现在的产区几乎不用农家肥，原因是非常费工，且效果不明显。一些科研试验地也是以化肥为主要肥料，产品的品质没有显著降低。生产上的主要问题是，为了提高产量，过量施用氮肥，对品质造成了严重影响。跨属嫁接亲和性和共生性好的特性表明葫芦科是一个非常特别的科 [2] - [9] 。目前，葫芦科的砧木种类数量有限，在全科植物范围内调查各属植物作为砧木的可行性和表现对于推动产业的发展具有重要意义。种质资源遗传多样性的精准鉴定是资源创新利用的基础。

葫芦科植物的鉴定研究经历了形态学、细胞学、孢粉学、化学成分、RAPD、PCR-RFLP、AP-PCR、SSCP、SSR标记、DNA条形码技术等阶段，上述方法的局限在于实验操作不够便捷，获得的有分类价值的性状和/或信息位点的数量较少 [10] - [17] 。近年来，叶绿体全基因组序列的获取具有实验成本低、实验方法简单、信息量大等明显的优势，已成功地广泛应用于植物的物种鉴定和系统发生学研究 [18] - [31] 。为了促进葫芦科植物的资源保护和可持续利用，本文报道在分子水平上鉴定葫芦科植物资源遗传多样性的一种新方法。

2. 材料与方法

17份样品代表葫芦科的5个种和5个属。供试样品名称及其叶绿体基因组的序列号如表1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)。每个种取样2~5个体。根据本团队发表的方法 [18] [19] [20] [21] [28] [29] [30] [31] 编制分子分类检索表。利用MAFFTv7.055b软件 [32] (http://mafft.cbrc.jp/alignment/software)获得比对序列矩阵。比对后的序列矩阵的长度为164,778个核苷酸，由左向右，左端(5’-端)起的第1个核苷酸字母的位置编号为1，最右端的核苷酸字母的位置编号为164,778。用MEGA 7.0 [33] 和DnaSP v6软件 [34] (http://www.ub.edu/dnasp/)检测核苷酸变异位点(图1，表2)。每个物种的特有核苷酸变异位点作为分子分类性状，用于编写葫芦科供试样品的分子分类检索表(见图1)。以马桑科马桑属的尼泊尔马桑作为外群对照(表1和图2)，用MEGA 7.0软件的Tamura 3-parameter model参数模型推断系统发生关系(图2)。

Table 1. Samples and Genbank accession numbers of chloroplast genome sequences used in this study

表1. 供试样品及叶绿体基因组序列号

注：马桑(马桑科Coriariaceae马桑属Coriaria L.)为外群对照。

Table 2. Base composition of variable nucleotide sites for classification of the five species from five genera of the Cucurbitaceae

表2. 葫芦科5属/种的具有分类价值的核苷酸变异位点数目及碱基构成

注：^*该列的序号与检索表内的序号对应；^**核苷酸变异位点数(在4种碱基中的占比)；^***此列括号中，前一个数字是在物种特有变异位点总数(4952)中所占的比例；后一个数字是在全部核苷酸变异位点总数(6602)中所占的比例。

Figure 1. Molecular taxonomic key to five taxa from five genera in Cucurbitaceae based on the species-specific variable nucleotide characters from the complete chloroplast genome

图1. 基于叶绿体基因组的物种特有核苷酸变异位点的葫芦科5属5个种的分子分类检索表

Figure 2. Phylogenetic tree of the five Cucurbitaceae genera (taxa) based on complete chloroplast genome sequences using the neighbour-joining method with the Tamura3-parameter model. The numbers near the branches are bootstrap support values (%) of 1000 replications

图2. 基于叶绿体全基因组序列的葫芦科5个属(种/亚种)的系统发生关系。分支图中的数字为1000次重复抽样的自展支持率

3. 结果

葫芦科供试样品的叶绿体全基因组的长度为156,011 (MF536698.1, Cucumis melo subsp. agrestis)~159,238 (MN723867.1,Indofevillea khasiana)个核苷酸，比对后的序列矩阵的长度为164,778个核苷酸。在比对序列中，共检测到6602个核苷酸变异位点，占叶绿体基因组序列全长的~4.23%。其中，各物种的特有核苷酸变异位点数目合计为4952个核苷酸，占变异位点总数的75.01%。马瓟瓜Cucumis melo subsp. agrestis (1753)和黑子南瓜(1542)的特有变异位点数目分别占物种特有变异位点总数的35.40%和31.14%，显著多于西瓜(727)、藏瓜Indofevillea khasiana (623)和罗汉果(307)。罗汉果的特有变异位点的数量最少，仅占物种特有变异位点总数的6.20%。马瓟瓜的特有变异位点中，T的比例(29.78%)均高于A、C或G (22.48%~24.30%)。黑子南瓜的特有变异位点中，A的比例(19.52%)低于T、C或G (24.97%~28.15%)。西瓜的特有变异位点中，A或T的比例(18.57%或21.46%)低于C或G (30.67%或29.30%)。藏瓜的特有变异位点中，T的比例(20.55%)低于A、C或G (25.04%~27.61%)。罗汉果的特有变异位点中，C的比例(21.82%)低于A、T或G (25.73%~26.71%) (表2)。特有变异位点的数量和核苷酸构成存在种/属间差异。利用种级水平的特有核苷酸变异位点编制分子分类检索表，供试样品得到精准鉴定(图1和图2)。供试样品的系统发生关系框架树状图中，罗汉果属和藏瓜属位于相对基部位置，西瓜属和黄瓜属位于较为进化的位置(图2)。

4. 讨论

葫芦科标本的最早采集日期记录是1900年7月11日。经过120多年的积累，中国数字植物标本馆(http://www.cvh.ac.cn/spms/list.php?taxonName=&family=Cucurbitaceae)目前拥有来自国内外的葫芦科植物标本29,263份，包括形态特征图片和文字描述。利用关键词“Cucurbitaceae”搜索到的名称中，有一些名称的字母输入错误，也有的标本名称鉴定有误，有待更正。佛手瓜属Sechium P. Browne为葫芦科的刺果瓜属Sicyos L.的异名。凤瓜属Gymnopetalum Arn.为葫芦科的栝楼属Trichosanthes L.的异名。帽儿瓜属Mukia Arn.为葫芦科的黄瓜属Cucumis L.的异名。Pilogyne Schrad.和Neoachmandra W.J.de Wilde & Duyfjes为葫芦科的马瓟儿属Zehneria Endl.的异名。Rytidostylis Hook. & Arn.为葫芦科的小雀瓜属Cyclanthera Schrad.的异名。Edgaria C.B. Clarke和三裂瓜属Biswarea Cogn.为葫芦科的波棱瓜属Herpetospermum Wall. ex Benth. & Hook.f.的异名。Bryonopsis已修订为葫芦科的毒瓜属Diplocyclos (Endl.) T.Post & Kuntze。Elaterium Mill.为葫芦科的喷瓜属Ecballium A. Rich.的异名。Ctenolepis Hook.f.为葫芦科的睫苞瓜属Blastania Kotschy & Peyr.的异名。Macrozanonia Cogn.为葫芦科的翅葫芦属Alsomitra (Blume) Spach的异名(https://tnrs.biendata.org/)。中国的植物标本馆收藏的葫芦科植物合计有50属(表3)，占葫芦科的属的全球总数(95)的约52.63%。少数的属的馆藏标本数量较多，如，栝楼属(7050)、赤瓟儿属(6549)和绞股蓝属(3674)。低于3份标本的属有8个。约45%的葫芦科植物标本的采集日期为50年以前。这些标本材料尚不足以支持全面研究葫芦科植物种(属)的分子鉴定和系统发生关系。部分物种的标本数量较多或较少的原因是，一直为了完成调查采集区域争取逐步覆盖一遍全国的国土面积，有的物种自然分布较广，有的物种局限分布于较狭窄的地理区域。分布较广的物种也需要详细观察不同地理区域的遗传变异。每次野外采集的覆盖面积内，通常需要在当地将植物标本用标本夹平整地夹住固定好，吹热风干燥后带回，对于不认识的植物，先按照不一样的种类各采集一些植株带回。由于国土或全球面积较大，没有经费支持前去采集的地方，尽可能请正在做专类植物研究的项目组到野外时顺便带一些其它植物种类的标本回来，赠送标本馆。从野外带回来的植物标本，很多情况下需要1年或几十年之后才能找到能够识别鉴定名称的专家在标签上填写上植物的名称。因此，在标本馆的建设和发展过程中，应该集思广益进行100多年来的阶段性总结，例如，馆藏有100份标本以上的每个物种，发挥过什么作用，有名称的标本经历过多少次名称更正、具有各种必要器官的合格标本的数量和占比、是否提供过形态性状的测量或DNA提取服务等)，制定明确的后续目标，比如全球460多个科16,000多个属的植物，哪些科属种的植物标本应该如何补全，每个物种最少和最多应该收集保存多少份标本，在后基因组时代，如何最大化发挥标本的作用。由于涉及领域较多，标本馆的直接在岗人员单独难以总结到位，国际上的经验是联合多方面通过项目推动。例如，对21国40个植物标本馆的4500份标本的取样调查结果显示，50%以上的热带植物标本存在名称鉴定错误 [35] 。同物异名和同名异物的存在是导致研究进展缓慢的原因之一。植物鉴定仍然是具有挑战性的世界性课题 [36] [37] 。随着分子技术的迅猛进步，植物种分子鉴定的研究受到样品采集滞后的严重制约。这样的窘境也存在于其它植物的科 [30] [31] 。我们的研究结果显示，叶绿体基因组的单核苷酸变异位点信息，可用于植物资源遗传多样性的分子鉴定 [18] [22] - [31] 。对于标本馆的关键植物标本(科属种水平上具有代表性的标本)，叶绿体全基因组序列数据应该像物种学名、标本编号、形态图片、形态特征描述那样成为标准配置的特征信息。

Table 3. Fifty genera of the cucurbitaceae in Chinese virtual herbarium

表3. 中国数字植物标本馆收藏的葫芦科植物50属

现代嫁接技术的研究已有100多年的积累，虽然解决了一些生产上的难题，但是，也发现了不少问题。有些物种的抗病菌的抗原必须扩大范围，在葫芦科其他属中寻找 [5] [6] [7] [8] [38] 。黄瓜、西瓜和甜瓜为葫芦科的不同属的植物，除了采用本属植物作为砧木外，也经常利用葫芦科的南瓜属的幼苗作为砧木培育嫁接苗进行繁殖。常见的南瓜砧木有黑子南瓜、黄籽南瓜、白籽南瓜、褐籽南瓜、杂交一代南瓜砧木品种(如“北农亮砧”)等。“根力神”可以作为黄瓜、甜瓜和西瓜三类作物的嫁接砧木，嫁接亲和力和成活率高，根系发达，发芽整齐，生长势强，抗枯萎及早衰能力强 [4] [5] [6] [9] 。野生西瓜作为砧木的缺点是抗病效果不彻底，用南瓜作为砧木时，多数情况下对西瓜果实品质有一定的不良影响。虽然选育出了一些对西瓜品质影响相对较小、可作为砧木的南瓜品种，但不够理想，在生产上仍然处于能不用还是尽量不用的状况。因此，应该通过协作研究，在全球范围内搜集、引种、保存葫芦科的全部物种的活植物，建立包括每一种基因型的叶绿体基因组序列数据库，在精确分类鉴定的基础上，进行不同基因型组合的嫁接试验，深入评估嫁接亲和力、共生亲和力以及砧木对接穗果实品质的影响等，为葫芦科种质资源的保护和合理利用提供技术基础。类似的相关研究内容和工作量通常较为浩瀚，需要全球格局、新思想、新技术以及可贵的协作精神的推动，应该创造条件，至少让研究贡献在平均值以上的科研工作者有机会进行较为频繁的跨学科接触和交流，营造浓郁的智慧思考氛围，有助于培育出更多的新成果，促进植物科学和相关产业的大跨度发展。

5. 结论

葫芦科资源多样性鉴定研究一直处于利用少量样品的方法探索阶段。生产方面的候选砧木局限于常见的少量市售种类。扩大种类范围进行嫁接试验和研究，挖掘更多的砧木资源有助于实现绿色高质高效的蔬菜产业发展。我们的新方法首次利用叶绿体全基因组序列大数据，提供了较丰富的遗传变异信息，操作也更加简捷，为葫芦科全球资源遗传多样性鉴定研究和大规模产业化利用提供了技术基础。

致谢

本研究得到天津市人力资源和社会保障局及天津市人力资源建设服务中心宁波老师以及国家专业技术人才知识更新工程项目的大力支持。徐秀萍老师和刘艳磊老师给予了有意义的讨论和指导。本调查过程中，得到国家植物标本资源数据库(National Plant Specimen Resource Center)平台以及戎素平和韩芳桥的热情支持。

基金项目

国家自然科学基金项目(No. 31770744)。

NOTES

^*通讯作者。