基于网络药理学以及分子对接技术探讨白芍对于抽动症的作用机制

Exploration of the Mechanism of Paeonia lactiflora Pall. (White Peony) in the Treatment of Tourette Syndrome Based on Network Pharmacology and Molecular Docking Technology

摘要: 目的：查询筛选白芍治疗抽动症的靶点、通路，明确白芍治疗抽动症的机制。方法：通过使用国家中药系统药理学研究平台(TCMSP)，将筛选的标准定义为生物利用度(OB) ≥ 30%，类药性(DL) ≥ 0.18，挑选白芍的主要活性成分和功能靶位，利用DrugBank数据库、OMIM数据库、GeneCards数据库、DisGeNET数据库的基因靶位，检索与抽动症相关的疾病靶位，通过UniProt数据库挑选出白芍的成分以及和疾病靶点有关的基因位点，再通过Cytoscape 3.9.1软件构建一个白白芍物–有效成分–常见靶点–疾病网络图，并利用蛋白质相互作用(PPI)网络挑选出白芍治疗抽动症的核心疾病靶点。再通过DAVID数据库进行基因本体论(GO)生物过程分析和京都基因与基因组百科(KEGG)通路富集分析，预测核心靶蛋白的作用机制，并绘制GO柱状图和KEGG气泡图对数据进行可视化。最后，利用OpenBabel-2.4.1、AutoDockTools-1.5.7和PyMOL软件，验证了白芍有效成分与白芍核心靶点在抑制抽动症中的分子对接。结果：得到了β-谷甾醇、山萘素、芍药苷元、芍药苷等13个活性成分和SLC6A4、IL6、TNF、CYP3A4等29个关键靶点；通过使用GO功能富集分析，共得到332个GO项目(P < 0.05)，在这些项目中，化学突触传递以及腺苷酸环化酶抑制G蛋白偶联乙酰胆碱受体这两种通路作为发挥作用的成分起主要的调节作用。在KEGG富集分析的环节中，结果共包含26条信号通路(P < 0.05)，主要包括胆碱能突触、GABA突触以及神经活性配体–受体相互作用。结论：白芍可能通过β-谷甾醇、山萘素、芍药苷元、芍药苷等活性成分作用于SLC6A4、IL6、CYP3A4、TNF、CHRNA7等靶点，调节胆碱能突触、GABA神经突触、钙信号通路、神经活性配体–受体相互作用、环腺苷酸信号途径等信号通路，发挥缓解痉挛、改善肌肉张力和身体微循环等作用，从而达到防治小儿抽动症的目的。

Abstract: Objective: To investigate and screen the targets and pathways of Paeony in the treatment of Tourette syndrome and clarify the mechanism of Paeony in the treatment of Tourette syndrome. Methods: By using the National TCM System Pharmacology Research Platform (TCMSP), the screening criteria were defined as bioavailability (OB) ≥ 30%, drug class (DL) ≥ 0.18, the main active ingredients and functional targets of Paeony were selected, and DrugBank database, OMIM database, GeneCards database and DisGeNET database were used, and gene target sites related to Tourette’s disease are searched in genet database. Components of Paeony and gene sites related to disease target are selected through UniProt database. Then, a network diagram of Paeony-effective components-common targets-disease is constructed using Cytoscape 3.9.1 software. The protein-protein interaction (PPI) network was used to select the core disease targets of Paeony therapy for Tourette syndrome. Then, DAVID database was used for gene ontology (GO) biological process analysis and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment analysis to predict the mechanism of action of core target proteins, and GO histogram and KEGG bubble map were drawn to visualize the data. Finally, using OpenBabel-2.4.1, AutoDockTools-1.5.7 and PyMOL software, the molecular docking between the active components of Paeonia and the core targets of Paeonia in the treatment of Tourette’s disease was verified. Results: 13 active components, including β-sitosterol, naphthene, paeoniflorin and paeoniflorin, and 29 key targets, including SLC6A4, IL6, TNF and CYP3A4, were obtained. By using GO functional enrichment analysis, 332 GO items were obtained (P < 0.05). In these projects, two pathways of chemical synaptic transmission and adenylate cyclase inhibition of G-protein-coupled acetylcholine receptors play a major regulatory role as active components. In the KEGG enrichment analysis, the results included 26 signaling pathways (P < 0.05), mainly including cholinergic synapses, GABA synapses and neuroactive ligand-receptor interactions. Conclusion: Paeonia alba may act on SLC6A4, IL6, CYP3A4, TNF, CHRNA7 and other targets through β-sitosterol, naphthol, paeoniflorin, paeoniflorin and other active components, and regulate the signaling pathways, such as cholinergic synapses, GABA synapses, calcium signaling pathway, neuroactive ligand-receptor interaction, cyclic adenylate signaling pathway, etc. to play the role of relieving spasm and improving muscle tension and body microcirculation, so as to achieve the purpose of preventing and treating children with tic syndrome.

1. 前言

抽动秽语综合征(Tourette Syndrome, TS)作为一种常见的儿科临床疾病，是一种以突发性、不自主性、重复性、无节律性运动和发声抽搐为核心临床症状的神经精神疾病[1]。现今存在的最新的流行病调查结果显示，随着时间的增长，此类疾病在儿童中的发病率日益增高。

目前的统计学资料显示，在全球的学龄前儿童中抽动秽语综合征的发病率约为0.3%~0.9%，但是在中国该疾病的发病率却高达6.1%，这个数字远远高于国外[2]。“抽动秽语综合征”，又称“抽动秽语障碍”，本词在我国古代文献中并没有出现，但根据此类疾病的临床表现及相关体征的描述，我们可以从中找到一些相似点，而不同医家所著的文献对与本病相似的症状的描述也不尽相同，如“慢惊”、“瘛瘲”、“发搐”、“肝风证”等。现代中医学则大多认为本病属于中医“慢惊风”、“肝风证”、“筋惕肉瞤”、“抽搐”等范畴之中，其中以“慢惊风”和“肝风证”被承认的最多[3]。本病患儿的一些临床表现包括但不限于身体各部位的交替性的、不自主的抽搐以及声带痉挛等，而在中医理论中这些都是风邪的致病特征[4]。清朝医家唐宗海所著的《血证论》中说“肝为风木之脏”，可见肝脏与本病的发生密切相关。

肝脏是血液的主要储存、主要排泄之处，性如调大，通体阴阳，通体血、津气之机疏通、通畅具有重要意义[5]。而白芍为中医治疗肝风证的临床常用药[6]，因此选取白芍作为研究治疗TS的药物。

白芍于《神农本草经》最早出现，现今收录在《中华人民共和国药典》中。其味苦、酸，性微寒，归肝、脾经，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳之功效，中医常用于治疗胸腹胁肋疼痛、汗证[7]。目前白芍对于TS的作用机制尚不清楚，仍需要日益精进的科技手段进行进一步的探索。

网络药理学强调从系统层次和生物网络的整体角度出发，解析药物及治疗对象之间的分子关联规律，其研究理念与中医药学的整体论思想不谋而合，被广泛应用于药物和中药活性化合物发现、整体作用机制阐释、药物组合和方剂配伍规律解析等方面，为中药复杂体系研究提供了新思路，为临床合理用药、新药研发等提供了新的科技支撑[8]。因此，本研究在网络药理学的基础上，探讨分析白芍治疗TS的核心活性成分、主要信号通路和关键靶点，并利用分子对接技术对结果来进行验证，以期为白芍治疗TS更进一步的临床应用和更深层次的学术研究提供指导和理论依据。

2. 材料与方法

2.1. 白芍活性化合物及靶标蛋白的筛选

国家中药分析系统平台，即TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)数据库，是一个包含草药、相关蛋白质靶点及其药代动力学特性的许多化合物的平台，通过使用TCMSP数据库，在关键词中输入“白芍”后，检索出白芍中的有效成分。定义2个属性值，口服可用量(OB) ≥ 30%，类药物(DL) ≥ 0.18用于活性成分的初步筛选[9]，检索时限从建库至2022-10-01，筛选出活性化学成分及相应的潜在靶标信息。通过UniProt数据库(https://www.uniprot.org) [10]对目标人类基因名进行匹配，并对所选目标基因进行标准化，得出白芍可能存在的靶点[11]。

2.2. 疾病靶点的筛选

通过OMIM (https://omim.org/)、DrugBank (https://www.drugbank.ca/)、DisGeNET (https://disgenet.com/)和GeneCards (https://www.genecards.org/) [12]，以“Tourette syndrome”为关键词检索抽动秽语综合征对应目标，再将该靶点和白芍对应的靶点导入Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在线软件获取交集，得出白芍治疗抽动症的共同作用靶点，并绘制出韦恩图｡

2.3. 药物靶点和疾病靶点的标准化和网络化构建

将上述操作中所获得的结果通过Cytoscape 3.9.1软件打开，构建出白芍治疗TS的“中药–活性成分–共同靶点–疾病”的网络，再根据上述的网络进行拓扑分析，其中，度的数值越大，这个成分越有可能为白芍治疗抽动症的潜在活性成分。

2.4. PPI网络的构建和筛选核心靶点

将2.3部分获得的共同靶点导入STRING在线数据库(https://string-db.org/) [13]，在左侧的选项中，将筛选条件设定为human，对所获得的结果进行蛋白分析，在得到药物–疾病共同靶点的相互作用关系后，将筛选条件设置为置信度 = 0.700 [14]。将得到的靶标信息导出并保存在tsv文件中，导入Cytoscape 3.9.1中，绘制并构建蛋白质相互作用的网络关系图(PPI)。利用CytoNCA插件对该网络进行参数分析[15]，将Betweenness、Closeness、Degree这3个选项作为参考标准分析，然后通过Degree值对所获得的数据进行排序，最后选取Degree值排序最高的10个靶点，以此作为白芍治疗抽动症的前10核心靶点。

2.5. 基因本体论(GO)生物过程和京都基因与基因组百科全书(KEGG)的通路富集分析

使用DAVID在线网站(https://david.ncifcrf.gov/)采用生物信息学方法对常见靶点进行富集分析[16] (P < 0.05)。包括生物过程(BP)、分子功能(MF)、细胞成分(CC)和KEGG通路的富集分析，并将这些富集的结果绘制成气泡图和条形图，最后在微生信在线分析可视化平台中绘制[17]。

2.6. 分子对接

在2.1中所获得的成分，根据药物的主要活性成分排名，然后选择前五位的活性成分，以此来和2.4中选择的前五位蛋白进行分子对接操作。并通过这一途径来证实所得活性成分和蛋白之间存在确切的相互作用关系。在PDB数据库(http://www.rcsb.org/)获得目标蛋白的3D结构，从TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)数据库中现在活性成分的3D结构，将所获得的文件导入AutodockTools 1.5.7软件中进行去水加氢的操作，然后将所获得结果保存为*pdb格式[18]。处理后对所获得的结果进行电荷的计算，并将内容设置为原子。设置结束后，将所得配体分子设置可旋转键，以方便后续的对接操作，设置结束后将所得配体保存为*pdbqt格式，将核心蛋白导入软件中，使用Vina工具进行下一步的分子对接。设置Gridbox以初级配体为中心，并调整大小，将所有氨基酸残疾包括其中，设置刚性对接，根据所得结合能进行排序，选择结合能最小的结果导出为*pdbqt格式，最后，利用PyMol软件将对接构象绘制成可视化模型[19]。

3. 结果

3.1. 活性化合物的筛选

在TCMSP数据库中，筛选出白芍的活性成分共85个。将筛选条件定义为以口服利用量(Oral Bioavailability, OB) ≥ 30%、类药物指数(Drug Like index, DL) ≥ 0.18，最终收纳入13个符合条件的成分，主要活性成分见表1。在从重复的目标中删除对应于活性成分的目标之后，最终获取白白芍物的靶点86个。

Table 1. Main active ingredients of Paeonia alba

表1. 白芍主要活性成分

药物	编号	主要成分	中文名称	OB	DL
白芍	MOL001918	paeoniflorgenone	芍药苷元	87.59	0.37
白芍	MOL001921	Lactiflorin	芍药新苷	49.12	0.8
白芍	MOL001924	paeoniflorin	芍药苷	53.87	0.79
白芍	MOL001925	paeoniflorin_qt	芍药苷_qt	68.18	0.4
白芍	MOL001930	Benzoylpaeoniflorin	苯甲酰芍药苷	31.27	0.75
白芍	MOL000211	Mairin	麦粒林	55.38	0.78
白芍	MOL000358	beta-sitosterol	β-谷甾醇	36.91	0.75
白芍	MOL000359	sitosterol	谷固醇	36.91	0.75
白芍	MOL000422	kaempferol	山萘素	41.88	0.24
白芍	MOL000492	(+)-catechin	(+)-儿茶素	54.83	0.24

3.2. 疾病靶点预测结果与韦恩图的绘制

在OMIM数据库、DrugBank数据库、DisGeNET数据库和GeneCards数据库中进行数据筛选，然后通过Excel的删除重复功能对所获得的有关抽动秽语综合征靶点进行删除重复操作，最终获得查重后靶点共1982个。通过使用Venny 2.1.0网站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)得到白芍治疗抽动症的潜在的作用靶点共计29个，并绘制韦恩图，见图1。

Figure 1. Common target Venn diagram

图1. 共同靶点韦恩图

3.3. 成分–药物靶点网络构建

通过使用Cytoscape 3.9.1软件，分别导入所得的药物有效成分，以及药物与疾病的共同靶点，进而构建出一个中药–活性成分–共同靶点–疾病的网络，详情见图2。其中共有35个节点、70条边，经拓扑分析后得到活性成分的度值，筛选出度值前四的活性成分分别是β-谷甾醇、山萘素、芍药苷元、芍药苷，推测这些活性成分可能为白芍治疗TS的核心活性成分。

注：绿色：活性成分，黄色：共同靶点，红色：中药以及疾病。

Figure 2. Traditional Chinese medicine-active ingredient-common target-disease network

图2. 中药–活性成分–共同靶点–疾病网络

3.4. PPI网络构建

将3.2中筛选的药物–疾病共有靶点导入String在线数据平台进行PPI分析(类别选Homospaiens)，总共获取29个蛋白质互作节点，99条边，平均节点度是6.83，见图3。将所获得文件以tsv格式保存，再将所获得的结果在Cytoscape 3.9.1中打开，并构建可视化网络图。在网络图的构建结束后，使用CytoNCA插件分析结果中的参数，以大于Degree、Closeness、Betweenness的中位数作为参考标准。最后检验得出的结果，所得出三个参数的中位数分别为B值是17.61280664、C值是0.509090909、D值是7，并在符合标准中的数据中通过Degree排序，最后选取Degree值高的前10个靶点[20]，分别为SLC6A4、IL6、CYP3A4、TNF、CHRNA7、CHRM1、HTR2A、ACHE、FOS、ADRB2，具体名称和筛选标准看表2。其网路图见图4。

3.5. GO生物过程和KEGG通路富集分析

将所有的29个靶点使用DAVID进行生物信息学分析后，共获得GO条目332条，其中，生物过程(BP)共含有110个，细胞组分(CC)的含量为24个以及35个分子功能(MF)，再把挑选的前提设置为P值，以此为依据，筛选出GO条目中，排名前10的结果，详情见图5。

KEGG富集的结果显示，符合P < 0.05标准的信号通路共有26条。所得通路中，能够在白芍治疗TS过程中起到重要作用的分别是腺苷酸环化酶——抑制G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、化学突触传递等生物过程；所涉及的细胞组成分别为突触前膜的整体、树突膜等；其他起到作用的成分中还包括神经递质受体活性、GABA-A受体活性等分子功能。

Figure 3. Protein-protein interaction network diagram of Paeonia alba in the treatment of Tourette syndrome

图3. 白芍治疗抽动症蛋白质–蛋白质相互作用网络图

Table 2. Top 10 core targets of Paeonia alba in the treatment of Tourette syndrome

表2. 白芍治疗抽动症前十核心靶点

GENE	中文名称	Degree	Betweenness	Closeness
SLC6A4	溶质载体家族6	14	139.5831357	0.666666667
IL6	白细胞介素6	12	93.47343016	0.608695652
CYP3A4	细胞色素P450，家族3，亚家族A，肽4	10	55.58425186	0.538461538
TNF	肿瘤坏死因子	9	36.40787905	0.528301887
CHRNA7	胆碱能受体，烟碱，α7	9	57.81985678	0.549019608
CHRM1	胆碱能受体，蕈毒碱1	9	40.07768865	0.518518519
HTR2A	5-羟色胺受体2A	9	75.0769616	0.595744681
ACHE	乙酰胆碱酯酶	8	46.73352203	0.549019608
FOS	鼠科骨肉瘤病毒癌基因同源物	8	38.33415441	0.571428571
ADRB2	肾上腺素能，β2受体	8	30.35569561	0.538461538

另外，TLR信号通路、IL-17信号通路等也在后面的通路中也呈现了一定的相关性，排名前10的通路见表3，表明多通路、多靶点参与了白芍治疗TS的过程。将筛选出的与此过程关系最密切的20条通路选取出来，并绘制成气泡图，详情见图6。

注：节点的颜色表示度值大小，节点的颜色由黄色至橘色对应的度值越大。

Figure 4. Network of action of common target PPI

图4. 共同靶点PPI作用网络

Table 3. KEGG pathway enrichment analysis information of Paeonia alba target

表3. 白芍靶点KEGG通路富集分析信息

ID	条目	中文名称	基因数	基因
hsa04080	Neuroactive ligand-receptor interaction	神经活性配体–受体相互作用	16	CHRM2, GABRA2, CHRM3, GABRA1, CHRM1, GABRA5, CHRM4, CHRNA7, GABRA3, ADRB2, HTR2A, OPRM1, F2, ADRA1B, ADRA1A, DRD1
hsa04020	Calcium signaling pathway	钙信号通路	9	CHRM2, CHRM3, CHRM1, CHRNA7, DRD1, ADRB2, HTR2A, ADRA1B, ADRA1A
hsa04725	Cholinergic synapse	胆碱能突触	7	CHRM2, ACHE, CHRM3, CHRM1, CHRNA7, CHRM4, FOS
hsa05033	Nicotine addiction	尼古丁成瘾	5	GABRA2, GABRA1, GABRA5, CHRNA7, GABRA3
hsa05032	Morphine addiction	吗啡瘾	6	GABRA2, GABRA1, GABRA5, GABRA3, DRD1, OPRM1
hsa05207	Chemical carcinogenesis-receptor activation	化学致癌–受体激活	7	AR, CHRNA7, CYP1A2, CYP1A1, FOS, ADRB2, CYP3A4
hsa04742	Taste transduction	味觉传导	5	GABRA2, GABRA1, CHRM3, GABRA5, GABRA3
hsa05204	Chemical carcinogenesis-DNA adducts	化学致癌-DNA加合物	4	GSTP1, CYP1A2, CYP1A1, CYP3A4
hsa00980	Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450	细胞色素P450对外源物质的 代谢	4	GSTP1, CYP1A2, CYP1A1, CYP3A4
hsa04727	GABAergic synapse	GABA神经突触	4	GABRA2, GABRA1, GABRA5, GABRA3

Figure 5. GO functional enrichment diagram of the action target of Paeonia alba

图5. 白芍作用靶点GO功能富集图

Figure 6. Bubble map of signal pathway enrichment information involved in the treatment of TS targets in the treatment of Paeonia alba

图6. 白芍治疗TS作用靶点参与的信号通路富集信息气泡图

3.6. 分子对接结果

运用Autodockvina将白芍的核心成分β-谷甾醇、山萘素、芍药苷元、芍药苷与筛选的核心靶点SLC6A4、IL6、CYP3A4、TNF、CHRNA7、CHRM1、HTR2A、ACHE、FOS、ADRB2进行分子对接，配体分子和受体蛋白能否结合在一起主要是通过结合能的数值进行评估，所获得的结合能小于0则说明配体能自发的与受体蛋白进行结合，如果所得结果小于−5.0 kJ∙mol⁻¹，那么说明结合能的性能好，所得结果越小，实验也显示阳性，其中白细胞介素6 (Interleukin 6, IL6)与4种受体蛋白均具有较高的对接活性，与山萘素的对接得分为−10.1，具有高度的对接活性，依据对接的得分值绘制表格(表4)和热图(图7)，同时绘制IL6与4种活性成分的对接构象中结合能最低的前三名图像(图8)。

Table 4. Docking score table

表4. 对接得分表

化合物	中文名称	结合能
		IL6	SLC6A4	CYP3A4	TNF	CHRNA7
kaempferol	山萘素	−10.1	−7.5	−6.3	−8.5	−8.4
paeoniflorin	芍药苷	−9.6	−7.8	−6.7	−9.1	−8.6
paeoniflorgenone	芍药苷元	−9.4	−7.2	−6.9	−8.8	−8.1
beta-sitosterol	β-谷甾醇	−7.8	−8.2	−8.0	−8.7	−8.9

Figure 7. Heat map of docking scores

图7. 对接得分值热图

(a) (b)

(c)

注：(a) IL6-山柰素；(b) IL6-芍药苷元；(c) IL6-芍药苷。

Figure 8. Top three lowest binding energy of IL6 to the active ingredient

图8. IL6与活性成分结合能最低前三名

4. 讨论

抽动秽语症是一种常发生在儿童身上的慢性精神类疾病，又被叫作儿童抽动秽语综合征。该疾病的特点是快速、突然、反复出现的不自主或部分不自主的运动和声音抽搐，可先后或同时发生。大多数儿童会伴有多动障碍、注意缺陷、强迫运动、焦虑、自闭症等精神症状[21]。

在古代的典籍中并没有抽动症的内容记载，但是在研究中发现，古代典籍中的痉证与所研究的病证高度相似。并且《黄帝内经》中也对此类病症的病因病机有所描述，“诸风掉眩，皆属于肝……风胜则动”此为对痉证的最早描述，与抽动症非常类似，又如“诸热瞀瘛……诸痉项强”亦与本病有密切的相关性[22]。《金匮要略》设“痉”病专篇，条文13条，载方3首，为后世医家开辟了治疗抽动障碍的理论先河，对指导临床具有重要意义[23]。在近现代，大多数的医生都认为抽动症大多由风邪所致，所以将其归类于慢惊风、肝风的范畴。

现代医学中，抽动秽语综合征是以慢性反复发作为主要特征的病证，严重者可遍及全身运动系统，好发于喉部，由于儿童年龄小、免疫力差，所以影响较大，若得不到有效治疗，会造成很严重的影响，但是在临床中，西药的治疗效果并不理想，只能做到缓解症状，并且还会伴有嗜睡、认知迟钝等不良反应，因此中药的运用对治疗该病有着非凡的意义[24]。

通过富集的结果体现出白芍是通过胆碱能突触、GABA神经突触等通路对TS产生的治疗作用。钙库控制的钙内流是介导细胞钙信号的重要途径之一，内质网上钙缺乏时，其基质上的蛋白会传递钙缺乏的信号，从而使细胞膜上的钙通道激活，将细胞外的钙离子导入到细胞质内，参与气管收缩、气道炎症等许多生物反应[25]。而胆碱能神经元的突触传递是谷氨酰胺能神经元、胆碱能神经元和γ-氨基丁酸神经元之间非常重要的通信方式[26]。现今将有生物活性并且能够与受体进行结合的物质定义为配体，机体内部也存在配体。受体的作用不仅仅是与配体进行结合，在靶细胞中传递信息也是受体的机能之一。它们也可以直接与靶细胞进行作用，或者通过激发细胞的功效，使其合成和释放第二信使，达到产生效果的目的。

综上所述，本文借助网络药理学和分子对接初步分析发现，白芍可能通过β-谷甾醇、山萘素、白芍苷元、白芍苷等活性成分作用于SLC6A4、IL6、CYP3A4、TNF、CHRNA7等靶点，调节GABA神经突触、胆碱能突触、环腺苷酸信号途径以及钙信号通路等信号通路，发挥缓解痉挛、改善肌肉张力及身体微循环等作用，从而达到防治TS的目的。本研究存在一定的局限性，不论是从中药有效成分，还是从疾病靶点信息，在不同数据库之间存在差异，最终获得的信息都可能会导致结果出现差异性。

通过本研究，在一定程度上证明了白芍治疗多发性抽动症的可行性，也为今后进一步的实验研究和药物开发提供了方向和理论依据。

NOTES

^*通讯作者。