1. 引言

腹泻型肠易激综合征(Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome, IBS-D)，是一种以腹痛、腹泻为主要表现的慢性肠道功能紊乱疾病，肠易激综合征(IBS)全球发病率为11.2%，IBS-D患者中抑郁症(Depression)患病率达到37.1% [1]。抑郁症与IBS-D存在明显关联，抑郁症患者的常伴有胃肠道功能紊乱的症状[2]，据《肠易激综合征中医治疗共识意见》以及相关文献报道，IBS-D主要为肝郁脾虚型，主要病因为肝失疏泄、脾失健运[3] [4]，情志不畅则肝失条达，肝气郁结，横逆克脾，引发疏泄[5]，中医“脾藏意”理论分析，脾主忧愁，意不能藏，则郁病健忘，脾虚湿盛是腹泻发病原因[6]。现代医学研究表明，抑郁症脑肠轴的功能失调可能导致肠道动力学的改变，从而加重腹泻型肠易激综合征[7] [8]，这与肠神经与中枢神经的双向调节机制“脑肠轴”相关[9]。

四神汤是中国东南一带传统食疗方，由茯苓、莲子、芡实、淮山药组成，具有健脾益气、健胃止泻等功效，用于消化不良、大便溏泻、免疫力低下[10] [11]。其中，茯苓补中益气，健脾养胃，对于因脾虚导致的泄泻、带下、消化不良等症状改善[12]；莲子安神养心、交通心肾，虚烦失眠[13]；芡实健脾止泻，祛湿止带[14]；山药补脾养胃，生津益肺，补肾益精，敛阴止泻[15] [16]。四神汤对IBS-D肝郁脾虚症患者有改善病状的作用[17]，四神汤针对抑郁症与IBS-D肝郁脾虚的共同病机，通过调理肝脾、疏解情志的方式，双向调节脑肠轴，改善肠道和抑郁的双重症状，达到“异病同治”效果。

本研究将采用R语言以及分子对接等方法技术，结合网络药理学，筛选四神汤中关键成分与伴有抑郁症的IBS-D的靶点，探讨四神汤干预伴有抑郁症的IBS-D的潜在机制，为四神汤的开发应用提供理论依据。

2. 资料与方法

2.1. 四神汤化合物的筛选

通过TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)检索茯苓、莲子、芡实、山药中有效组分，从中获取符合口服生物利用度(OB) ≥ 30%、类药性(DL) ≥ 0.18两个指标的化合物，并确定其靶点基因。通过Uniport数据库(https://www.uniprot.org/)标准化基因名称。

2.2. 疾病靶点的获取

在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)、TDD数据库(https://db.idrblab.net/ttd/)和OMIM数据库(https://www.omim.org/)中，IBS-D以“Diarrhea-predominant irritable bowel syndrome”或“Diarrhea irritable bowel syndrome”为关键词，抑郁症以“Depression”或“Depressive disorder”为关键词，对这两种疾病的相关基因进行查找，获取score中位数以上基因，去除重复基因，利用R4.1.1软件数据处理，疾病基因与成分靶基因取交集，绘制韦恩图。

2.3. 复方与疾病靶点网络构建

使用Cytoscape3.10.2软件构建四神汤–成分–靶点–伴有抑郁症的IBS-D三者之间网络，节点代表中药、成分与靶点，边的条数代表它们的关系紧密程度，拓扑计算其度中心度(degree centrality, DC)值，对节点的关系进行分析。

2.4. 蛋白互作网络(PPI)建立

将四神汤干预抑郁症与IBS-D的靶点，输入蛋白互作网络STRING (https://cn.string-db.org/)，设置高置信度“>0.7”，获取蛋白互作网络(protein-protein interaction network, PPI)，借助Cytoscape平台绘制PPI网络图，通过CytnNCA计算介数中心度(betweenness centrality, BC)、接近中心度(closeness centrality, CC)、DC、特征向量中心度(eigenvector centrality, EC)、局部平均连通性(local average connectivity, LAC)、网络整体分析(network characteristics, NC)，通过数值进一步筛选核心基因。

2.5. 核心靶点基因GO和KEGG分析

使用R4.4.1软件中enrichplot 1.2和clusterProfiler 4.12等工具对四神汤干预抑郁症与IBS-D作用靶点进行基因本体(gene ontology, GO)和京东基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)信号通路分析，设置p < 0.05与q < 0.05为检验显著性的筛选条件，GO生物学过程(BP)，细胞组成(CC)，分子功能(MF)分别取前10条目，KEGG通路取前20条目，分别用R语言中ggplot2 3.5.1工具作图。

2.6. 成分–靶点–信号通路网络构建

四神汤成分、靶点、信号通路进行信息整合后，通过Cytoscape建立四神汤成分与靶蛋白与信号传导途径之间的网络。

2.7. 分子对接及可视化

根据上述PPI网络筛选出3个重要靶点，分别与相关成分进行分子对接。考虑网络药理学具有网络属性，缺乏成分对蛋白靶点实际治疗作用，临床治疗焦虑抑郁型IBS-D与5-羟色胺(5-HT)水平直接显著相关[18]，所以结合与5-HT相关的核心靶点，对其分子对接。在Uniprot数据库中查找靶点对应的“Homo”蛋白名称，并通过RCSB Protein Data Bank数据库(https://www.rcsb.org/)获得蛋白结构，使用PyMOL 3.0.4程序进行蛋白去水、去配体的处理，借助Autodock tool工具对蛋白加氢。运用Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取各成分结构后，通过Chem3D22.0.0处理配体。在Autodock vina中结合R语言采用了分子配对技术，以分析靶蛋白与特定分子之间的作用方式，通过PyMOL程序实现可视化。

3. 结果

3.1. 四神汤化合物的筛选

在TCMSP数据库中，除去无靶点的成分，从四神汤中得到29个活性成分(茯苓6个，莲子9个，芡实2个，山药12个)和与活性成分相关的靶点225个(表1)。

Table 1. The active compounds in Sishen decoction

表1. 四神汤的活性化合物表

3.2. 疾病靶点的获取

获得IBS-D靶点2561个，抑郁症靶点4007个，这两种疾病的共同靶点为1797个。通过交集四神汤的作用靶点与IBS-D与抑郁症的靶点，获得111个共同靶点，作为四神汤治疗伴有抑郁症的IBS-D的靶点，详见韦恩图(图1)。

Figure 1. Venn diagram of common targets of Sishen decoction ingredients and IBS-D with depression

图1. 四神汤成分与伴有抑郁症的IBS-D的共同靶点韦恩图

3.3. 复方与疾病靶点网络构建

使用Cytoscape平台构建四神汤成分和靶点的交互网络，如图2所示，其包含139点与291条边，经degree值知其中关键化合物为槲皮素(quercetin, MOL000098)、木犀草素(luteolin, MOL000006)、β-胡萝卜素(beta-carotene, MOL002773)、荷叶碱(nuciferin, MOL007213)、薯蓣皂苷元(diosgenin, MOL000546)多种活性成分。

注：FL代表茯苓，LZ部分代表莲子，QS代表芡实，SY代表山药。颜色越深，Degree值越大，该节点越关键。

Figure 2. Sishen decoction-active ingredients targets-disease network diagram

图2. 四神汤–活性成分–作用靶点–疾病网络图

3.4. 蛋白互作网络(PPI)建立

四神汤干预抑郁症与IBS-D的PPI，详细见图3A，根据degree值排列网络，见图3B，包含104个点，852条边。筛选出大于对应的中位值的靶点(BC > 522.553 221 3, CC > 0.565 951 152, DC > 44, EC > 0.197 936 803, LAC > 19.1, NC > 34.936 672 623)，得到前3位核心靶点为白细胞介素-6 (Interleukin-6, IL-6)、AKT丝氨酸/苏氨酸激酶1 (AKT serine/threonine kinase 1, AKT1)、肿瘤蛋白p53 (Tumor protein p53, TP53) (表2)。

注：A为PPI网络图；B为按degree值排列PPI网络图，颜色越深，degree值越大，靶点越关键。

Figure 3. Intersection gene PPI network diagram

图3. 交集基因PPI网络图

Table 2. Topological parameters of the top three targets of the PPI network of the intersection genes of Sishen decoction in the intervention of IBS-D and depression

表2. 四神汤干预抑郁症与IBS-D的交集基因的PPI网络的前3位靶点的拓扑参数

3.5. 核心靶点基因GO和KEGG分析

注：q值越小颜色越深，富集相关程度越大；柱状条越长，气泡越大，富集数量越多。

Figure 4. GO analysis of Sishen decoction on the targets of IBS-D with depression (A) and KEGG pathway enrichment analysis of Sishen decoction on the targets of IBS-D with depression (B)

图4. 四神汤对伴有抑郁症的IBS-D的靶点的GO分析(A)及四神汤对伴有抑郁症的IBS-D的靶点的KEGG通路富集分析(B)

根据GO柱状图与KEGG的气泡图(图4)可知，四神汤干预抑郁症与IBS-D的生物过程主要与氧化应激反应(response to oxidative stress)、氧气水平变化反应(response to oxygen levels)、活性氧反应(response to reactive oxygen species response)相关；细胞组成包括膜阀(membrane raft)、突触膜(synaptic membrane)、膜微区(membrane microdomains)等；分子功能主要有泛素蛋白连接酶结合(ubiquitin protein ligase binding)、DNA结合转录因子结合(DNA-binding transcription factor binding)、RNA聚合酶Ⅱ-DNA-转录因子结合(RNA polymerase Ⅱ-DNA-transcription factor complex binding)等。四神汤干预伴有抑郁症型IBS-D的KEGG通路前20条涉及到炎症、免疫相关通路，主要涉及PI3K-AKT (磷脂酰肌3–激酶–蛋白激酶B，hsa04151)等。

3.6. 成分–靶点–信号通路网络构建

借助Cytoscape3.10.2应用程序，构建出四神汤的成分与靶点与通路与疾病的网络，详细见图5。其中，涉及24种成分，111个靶点，20条通路，提示四神汤协同多种成分、多个靶点和多条通路，发挥干预伴有抑郁症的IBS-D的效应。

Figure 5. Network diagram of Sishen decoction ingredients-targets-signalling pathways

图5. 四神汤成分–靶点–信号通路网络图

3.7. 分子对接及可视化

将PPI网络中前3个靶点IL-6、AKT1、TP53以及伴有抑郁症抑郁型IBS-D与5-HT显著相关的2个靶点HTR2A、HTR3A与对应的活性成分之间展开分子对接。其结合能数据及部分可视化图，如表3、图6所示，结合能 < −5 kcal/mol，表明对接均结合稳定。其中活性成分亚荷叶碱、美罂粟碱及pronuciferin配体对接HTR3A蛋白受体，荷叶碱、pronuciferin配体对接HTR2A蛋白受体，薯蓣皂苷元配体对接AKT1受体和TP53受体的结合能 < −8 kcal/mol，具有强的亲和力。

Table 3. Docking scores of Sishen decoction and core target molecules

表3. 四神汤和核心靶点分子对接分值表

注：A为木犀草素与IL-6；B为槲皮素与IL-6；C为槲皮素与AKT1；D为薯蓣皂苷元与AKT1；E为木犀草素与TP53；F槲皮素与TP53；G薯蓣皂苷元与TP53；H为荷叶碱与HTR2A；I为荷叶碱与HTR3A。

Figure 6. Visualization results of docking of Sishen decoction with target molecules of depression IBS-D with depression

图6. 四神汤与伴有抑郁症的IBS-D靶点分子对接可视化结果图

4. 讨论

Bai C等[19]对临床试验数据进行Meta分析，发现槲皮素、木犀草素等对伴有焦虑和抑郁的IBS-D有显著的治疗效果。木犀草素、槲皮素具有抗炎作用，通过抑制血清及组织中的促炎因子，缓解肠道炎症[20]。β-胡萝卜素具有清除活性氧，降低氧化应激水平，维持肠道屏障稳态的作用[21]。荷叶碱作为一种5-羟色胺受体拮抗剂，对情绪有调节作用[22]。薯蓣皂苷元则通过抑制炎症因子的产生，能够缓解多种与炎症相关的疾病[23]。以上研究报道与我们筛选出的核心成分和分子对接数据相吻合，表明槲皮素、木犀草素、β-胡萝卜素、荷叶碱、薯蓣皂苷元是治疗抑郁症与IBS-D的关键成分。

PPI网络图显示，四神汤干预伴有抑郁症的IBS-D的核心蛋白为IL-6、AKT1、TP53等。这些核心靶点主要涉及PI3K-AKT信号通路，其激活可降低炎症因子水平、促进海马神经发生、并调控突触可塑性等，在抑郁症和腹泻型肠炎中有关键作用[24]。IL-6在炎症反应中通过参与PI3K-AKT信号通路的转导，发挥着核心作用[25]，且IL-6作为炎症标志物之一，与抑郁症的发生相关[26]。AKT1是PI3K-AKT信号通路的核心激酶，被列为治疗IBS潜在的靶点[27]。TP53转录因子负调节细胞生长，调控细胞周期停滞、细胞衰老、DNA修复、代谢适应和细胞死亡，并在炎症应激反应有重要作用[28] [29]。5-HT是脑肠轴关键的信号媒介，其中HTR2A调节5-HT信号传导和神经元活动，HTR3A则参与中枢神经、交感及副交感神经，调节焦虑情绪和肠胃蠕动等[30] [31]。IL-6、AKT1、TP53、HTR2A和HTR3A是调控抑郁症与IBS-D的关键蛋白。

GO富集分析提示四神汤可能通过作用于泛素连接酶、DNA结合转录因子，参与肠道炎症、氧化应激等生物过程，从而保护肠神经免受应激和炎症产生的活性氧引起的受损[32]。KEGG通路富集分析也揭示了四神汤可能干预伴有抑郁症的IBS-D相关的PI3K-AKT信号通路，推测槲皮素、木犀草素、β-胡萝卜素能够激活该通路的AKT1激酶，调控磷酸化过程，抑制下游丝裂原活化蛋白激酶–细胞外调节蛋白激酶(MAPK- ERK)信号通路磷酸化，并上调Nrf2 (Nuclear factor erythroid 2-related factor 2)表达，从而恢复肠道功能，来缓解抑郁与肠道症状[33] [34]。槲皮素和木犀草素可能通过抑制IL-6、AKT1蛋白，降低血清中IL-6、IL-1β、TNF-α促炎因子水平，以缓解肠道炎症，还可以调节肠道代谢物如短链脂肪酸的表达，进而影响脑肠轴的功能[35]；槲皮素可能通过作用TP53，调节细胞周期停滞和细胞死亡，从而帮助恢复肠道屏障功能[36] [37]；β-胡萝卜素作用AKT1，调控BDNF (Brain-derived neurotrophic factor)的mRNA 表达，促进突触可塑性[38]，推测能改善抑郁症；薯蓣皂苷元作用TP53，从而减缓或抑制肠上皮细胞的过度增殖[39]，并且能抑制由脂多糖/干扰素γ引发的c-Jun氨基末端激酶、核因子-κB激活，减少炎症反应[40]；荷叶碱可能通过5-HT信号通路调节肠脑轴稳态，抑制肠道中HTR3A蛋白受体，减少IBS-D患者的内脏高敏反应[41]。四神汤成分–靶点–信号通路网络展现出多成分、多靶点、多通路协同作用的特点，推测四神汤能够通过调节肠道炎症、氧化应激和肠脑平衡来治疗抑郁症与腹泻型肠炎，实现“异病同治”。

综上所述，本研究系统探讨了四神汤成分–病因机制–信号通路之间关系。通过网络药理和分析对接初步地阐明了IBS-D的潜在机制，提示四神汤干预伴有抑郁症的IBS-D，潜在成分为槲皮素、木犀草素、荷叶碱、薯蓣皂苷元等；调控靶点为IL-6、AKT1、TP53、HTR2A、HTR3A；作用方式和炎症、氧化应激、细胞增殖密切相关，影响病理的通路涉及PI3K-AKT和5-HT等。四神汤治疗的确切作用机制需药理实验进行验证。

基金项目

咸宁市科技计划重点项目(2023SFYF069)。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献