1. 引言

感染性疾病是全球范围内导致人类发生疾病和死亡的重要病因[1]。感染性疾病中的下呼吸道感染，尤其是肺炎，每年可导致约440万人死亡，其中90%以上为儿童[2]。感染性疾病的精准治疗以及确定治疗方案的关键在于快速明确病原微生物。然而，传统的病原学诊断方法如体外高通量测序技术、质谱法、形态学、免疫相关的抗原抗体检测面临着耗时长且检出率低以及高度依赖临床医生对患者病情的经验性诊断等问题[3]。另外，一些特殊病原体如苛养菌、厌氧菌和病毒等不典型微生物培养条件苛刻，检出率更低[4]。规模上可以实现数千乃至数十亿个独立的DNA片段被平行即同时高通量测序的方法被称为下一代测序(NGS)。近年来，NGS技术已经广泛应用于临床及实验室。常见的有全基因组测序(WGS)、宏基因组下一代测序(mNGS)、病原体靶向高通量测序(tNGS)方法[5]。mNGS在病原体检测方面具有多种优势，它主要应用于快速高效精确找到病原体并可以指导抗菌药物的选择，另外在评估治疗效果方面也被证实具有指导作用。近年来mNGS的优势逐步受到临床的认可，但mNGS无法做到检测标本中的包括宿主细胞的全部核酸，另外mNGS的费用较高也限制了其在临床上的广泛应用。相较与mNGS，tNGS具有更简单和方便的优势。通过采用超多重聚合酶链式反应(PCR)扩增联合高通量测序技术，可以在24小时内快速识别数十到数百种已知病原微生物病原体及其抗生素耐药性或毒力基因，之后的种属鉴定和抗生素耐药基因分析仅需2小时即可完成，大大缩短了诊断时间[6] [7]，更适用于临床。

2. 靶向高通量测序的概述

2.1. 靶向高通量测序技术(tNGS)和宏基因组学二代测序(mNGS)的比较

靶向高通量测序技术的发展历程可以看作是建立在宏基因组学二代测序技术(mNGS)这一前沿成果的基础上。宏基因组学自2000年初开始应用于临床，最初是通过微阵列技术的引入而展开的。这一过程标志着宏基因组学在临床医学中的逐步实践和推广，为后续的靶向高通量测序技术的创新奠定了基础。早期该技术成功应用于SARS冠状病毒的发现、癌症突变的基因图谱，以及对人体不同部位微生物组的深入分析等方面[8]。随着近年来国内外对mNGS的深入研究，2018年版《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南》指出：“对罕见病原菌感染患者，常规病原体检测方法检测不出，可审慎地用二代测序技术检测病原体”[8]，2019年2月《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》明确mNGS临床适应症和应用范围更聚焦于疑难、危重、特殊感染性疾病的诊断[9]。相较mNGS，tNGS更好地规避了mNGS及其他常规检测低浓度特殊病原“漏检”的弊端，tNGS显著提高了低病原含量无菌体液样本的病原体阳性检出率。另外，相较与mNGS，tNGS解决了DNA和RNA无法共检以及病毒细分亚型困难、费用高昂等问题。多项临床研究表明tNGS在感染性疾病诊断研究中非常有潜力，如确诊博卡病毒、鹦鹉衣原体、水痘带状疱疹病毒、细小单胞菌、阿米巴脑膜炎、裂头蚴病感染等[10]。

2.2. 靶向高通量测序技术(tNGS)的原理及临床价值

靶向高通量测序技术无需预设、无需培养，其原理是是将多重聚合酶链反应(PCR)和二代测序技术结合，通过提取临床样本中DNA和RNA片段，针对目标病原微生物基因序列设计特异性引物，采用超多重PCR建库体系，对目标序列进行靶向正向扩增富集，最后对样本中所有核酸进行高通量测序、数据库比对和智能化算法分析，能够快速、准确地判断致病病原微生物的种类(包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等) [9]。

tNGS技术一次测序能够检测到超过一万种病原体，具有对新发病原体、罕见病原体、跨物种传播病原体、混合感染病原体以及传统培养方法无法检测到的阴性病原体进行识别的能力。针对由于破壁强度不同从而导致提取难度高的结核分枝杆菌、真菌、厌氧菌、诺卡菌和的检测也具有优势，另外有研究表明即使患者在检测前使用抗生素，tNGS的检出率受先前抗生素暴露的影响较小[11]。病毒易突变，即使是单点突变，也会对传播性、致病性和可被影响的宿主范围造成影响[11]。传统的检测手法可能无法检测到病毒的变异，究其原因主要是由于常规的病毒诊断主要只针对一种或几种特定引物进行靶向扩增，综上，如果一个病毒诊断平台可以实现对所有的病原体以及它的变异体都具有检测的能力那即是一个理想的病毒诊断平台。转录组新一代测序(tNGS)技术在病毒感染诊断方面展现了明显的优势，它的优势主要体现在扩大了覆盖广度和深度，有效解决了检测变异病毒的难题，并且对病毒基因序列的读取数量得到了显著提升。另外，有研究表明标本的采集部位会对研究结果产生影响，而tNGS检测覆盖全样本类型，tNGS样本来源包括脑脊液、体液、脓液、拭子、肺泡灌洗液、组织、痰液、血液等[12] [13]，有研究采用高通量靶向扩增测序对重症CAP患儿进行肺泡灌洗液病原体检测，结果与常规检查、多重PCR比较，tNGS敏感度和特异度均较高，可见tNGS在临床感染性疾病的诊断中具有巨大的应用价值。

3. tNGS在感染性疾病中的应用价值

3.1. tNGS在呼吸道感染中的应用价值

在呼吸道感染性疾病中，呼吸道细菌感染的病原菌以G⁺球菌为主，以金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和肺炎克雷伯菌常见[13]。有学者利用tNGS对西藏高原地区社区获得性肺炎(CAP)的病原学分布特征进行研究，发现G⁺球菌中检出率最多的是肺炎链球菌，G⁻杆菌中检出最多的为嗜血杆菌属[13]。下呼吸道感染(LRTs)病原体复杂，据报道，下呼吸道感染在成人和儿童中的发病率和死亡率高居第四位[12]，2019年死于下呼吸道感染的人数高达260万。有效治疗下呼吸道感染的关键是在早期对病原体做出明确诊断，LRTI病原学诊断的金标准为细菌培养和涂片镜检，作为临床传统的LRTI诊断方法存在低灵敏度、标本低特异度、周转时间较长，以及在单一标本中无法同时检出多种病原体的局限性[13]，tNGS为LRTI的病原体诊断提供了新的高效手段。

郑凯文等[14]针对临床上至少90%的下呼吸道病原体等自主设计了40对特异性引物，联合多重PCR与二代高通量测序实现了对肺炎克雷伯菌、化脓性链球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、卡他莫拉菌等20种LRTI常见病原体的高通量、快速检测。研究指出，tNGS在检测率及周转时间方面皆显著优于传统之法，于病原体识别领域具备颇高的灵敏度，尤为适用于快速甄别呼吸道感染病原体。

近年来，有研究报道肺部真菌感染的发病率以及死亡率逐年上升，免疫功能紊乱、免疫功能低下或长期使用抗菌药物等情况则常合并下呼吸道真菌感染。目前肺部真菌感染的诊断方法仍然存在很大的进步空间，肺部真菌检验面临着标本周转时间长、特异度低、易污染等问题。真菌细胞壁特别厚，利用用于提取真菌细菌遗传物质的技术可能会大大降低提取过程的效率。此外，重要的是要认识到检测真菌DNA的各种方法可以产生不同的结果。因此，在进行真菌研究和鉴定时，必须选择合适、准确的检测方法，以保证获得可靠、有意义的结果。在一项成人肺炎的研究中，采用了102例标本，并分别使用了tNGS和mNGS检测真菌，实验结果显示tNGS的检出率为12.56%，mNGS的检出率为13.45%，若改善破壁条件可提升真菌核酸提取率[15]，目前tNGS在呼吸道真菌感染鉴定中的研究较少，随着未来研究的深入，tNGS对真菌的检出很可能会优于常规培养法

3.2. tNGS在分枝杆菌感染性疾病诊断中的应用

分枝杆菌感染引起的肺结核以及非结核分枝杆菌引起的肺病是危害人类健康的重要慢性感染性疾病。目前常见的送检标本类型主要是痰、支气管肺泡灌洗液，在该细胞类型中检测出分枝杆菌即为诊断结核病或非结核分枝杆菌病的金标准，随着分子生物学在病原学诊断中的应用，通过tNGS针对病原学的检测对早期诊断分枝杆菌具有重大的意义。

Murphy [16]团队通过tNGS检测了72份样本和55个结核分枝杆菌复合群阳性培养物，结果表明tNGS可以通过标本或培养物检测到结核分枝杆菌复合群耐药性，并同时为结核病患者治疗提供重要信息。

针对结核性脑膜炎(TBM)患者相关研究表明，相较于抗酸杆菌，MGIT960培养脑脊液标本靶向高通量测序诊断结核分枝杆菌的敏感性可高达84.4%，最大化提升脑脊液结核杆菌的检出率[17]。

3.3. tNGS在中枢神经系统感染性疾病诊断的应用

中枢神经系统感染性疾病具有高发病率和病死率的特点，临床常见的疾病包括脑炎、脑膜炎以及脊髓炎等[18]。传统的中枢神经系统感染性疾病的诊断流程很大程度上依赖于病原体特异性检测，部分诊断治疗还需要借助侵入性外科手术，传统检测手段耗时长需数天到数周的时间[19]。针对中枢神经系统感染性疾病的辅助诊断，传统的方法已逐渐无法满足临床需求，而tNGS (转录组新一代测序技术)逐渐受到临床专家的高度重视。tNGS技术的出现，为中枢神经系统感染的精准诊断和治疗提供了新的可能性，从而推动了相关医疗实践的发展。

为了调查tNGS检测对感染性脑膜炎和脑炎的诊断价值，WILSON等[20]进行了大样本、多中心前瞻性研究，共纳入美国8家医院204例儿科和成人患者，样本类型均为脑脊液，在这204例病例中通过tNGS技术与常规检查的结合，有19例成功确诊了多种病原体，这些病原体包括病毒、细菌以及真菌。研究结果显示，在通过tNGS确诊的13例病例(占总数的22%)中，有7例(即54%)成功指导临床启动了相应的治疗。而其余6例则利用tNGS进行了包括耐药基因检测、病毒分型、动态监测和进化分析等多方面的深入研究。

针对中枢神经系统细菌性感染的患者，一项单中心、前瞻性队列研究表明，无论采用何种抗菌药物治疗，靶向高通量测序技术均优于培养法和其他常规方法等[21]，且采用tNGS技术在那些培养结果为阴性的患者中，tNGS技术可额外识别出了48种细菌和真菌，显示出其在微生物检测中的优势。

4. 小结

随着靶向高通量测序技术的不断进步，该技术正在实现以更低的成本更快、更全面地进行宏基因组学分析[22]。然而几乎所有研究都是回顾性的，尚未在大规模的前瞻性临床试验中建立临床实用性，尽管在多个病例报告和小病例系列中已经证明了使用靶向高通量测序可以明确致病微生物，但该技术仍然存在着不足之处[23]。究其原因主要由于宿主感染微生物的方式以及与微生物之间的相互作用复杂多样。另外，多种病原体存在检测困难及敏感性低的情况。某些细菌如结核杆菌因寄居在宿主细胞内部，常在体液中不易被检测到，这进一步降低了检测的敏感性。若检测报告中有其序列数，应考虑为致病微生物可能，不可忽略，有研究表明，tNGS在LRTI细菌检测中，阳性预测值在检测限介于10³~10⁴ CFU/mL时降低，从而阻止了低浓度生物病原体的检测，认为tNGS不能可靠地从临床标本中检测≤10³ CFU/mL标准培养中定量的细菌[24]。综上所述，尽管现有研究显示，靶向高通量测序在短期内不可能完全取代传统的诊断手段，但在特定的临床场景中，它能够发挥辅助性的检测作用。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。

参考文献