1. 引言
土壤微生物区系与周围植被组成关系密切，间作、轮作或套种是克服作物连作障碍的有效和根本途径 [1] [2] [3] [4] [5] 。而合理的轮作虽能缓解半夏的连作障碍，但由于半夏适生区面积有限，且间隔时间太长(4~5年)，无法实行轮作，致使半夏种植效益不稳定，药农积极性不高，不利于当地经济的发展。因此，半夏连作已成为限制产区半夏产量和品质提高的关键因素。近几年半夏的研究主要集中在半夏的丰产栽培与肥料的肥效等方面的研究 [6] [7] ，有关半夏连作障碍方面的研究目前仅见于从种子消毒、生物菌剂及遮阴相结合的方法 [8] 。主要是从宏观角度探讨半夏连作障碍的修复措施，但该措施大面积推广有一定的限制。同时，种子消毒会带来土壤和药材的污染和药材品质的下降。本文利用前期筛选的对半夏化感作用较强的带菌黑麦草 [9] ，选重茬地土壤和从未种植过半夏的土壤进行再植生物测试，评价不同处理方法对连作半夏微生物区系及其生长和病害的影响，探究不同处理方法在半夏连作障碍效应方面的缓解效果，希望为半夏连作障碍的生物防治提出一条新思路。
2. 材料和方法
2.1. 材料
供试土壤：来自西和县河坝乡草坪村连续种植半夏2a土壤。
供试植物：半夏种子购于西和县河坝乡草坪村村民，带菌和不带菌黑麦草种子由兰州大学农业科技学院实验室提供。黑麦草种子所带菌主要是与禾草共生的Neotyphodium属内生真菌。
2.2. 方法
2.2.1. 醉马草种子浸提液粗提物的制备
将带菌黑麦草种子洗净，用蒸馏水冲洗，室内自然风干并粉碎过筛。称取粉末样品200 g，放在1000 ml的容量瓶中，用丙酮在室温下分24 h、48 h、72 h浸提3次，然后合并3次提取液，浓缩后装入1000 ml容量瓶中定容，置于4℃冰箱内备用。
2.2.2. 黑麦草种子浸提溶液的制备
将上述准备好的粗提液用蒸馏水分别继续稀释至80 mg/ml、50 mg/ml两个不同浓度，置于4℃冰箱中供后续实验使用。
2.2.3. 黑麦草种子带菌检测
将黑麦草种子在5% NaOH + 1%苯胺蓝溶液浸泡过夜，自来水冲洗3次，加入0.8%的乳酚油苯胺蓝溶1液于玻璃试管，在水浴中沸煮20 min，使其充分染色，再用自来水冲洗3次，加盖16 mm × 16 mm的盖玻片，光镜(Leica, Germany)下检测内生真菌菌丝 [10] [11] 。
2.2.4. 试验设计
试验分盆栽和室外试验两部分，选择连作障碍效应试验的重茬地及其土壤，以带菌黑麦草种子浸提液浇灌处理(设50 mg/ml和80 mg/ml)、带菌黑麦草和半夏间作等方法进行处理，设空白处理为对照。盆栽设8个重复，每盆5粒。小区试验面积均为5 m × 3 m，每个处理重复3次。按农户种植方式，播种前均施农家肥和复合肥，并整平地块，耙细，半夏每两行中间种同面积的黑麦草。株距3 cm左右，行距5 cm。半夏种茎约1.5 cm。并在种植后开始第一次加入种子浸提液，盆栽每次加入300 ml，试验地每次加入30 L，每周加一次，共加四次。保证日照和水分。播种前种子经过消毒和浸种，生长期至采收期均采用统一管理。
室外实验地点位于甘肃省陇南市西和县河坝乡草坪村，属于甘肃省半夏主产地。地理位置在东经105˚30'与北纬34˚02'之间，海拔1692米，年平均降雨量500毫米左右，年平均气温8℃左右，全年无霜期约170天。属于暖温带半湿润性气候。土壤为褐土，pH 6.8~7.0，有机质含量 ≥ 10 g/kg，适宜于多种中药材生长，尤以所产半夏质优和原产地道地而驰名中外。
室内试验环境条件：位于甘肃工业职业技术学院化工学院实验室。土壤均采自西和县重茬地，与室外土壤相同。
3月28日种植半夏，其株高，茎叶重、茎粗、叶面积于6月12日测定，土壤可培养微生物、土壤酶活性、繁殖系数、发病率及总分枝数的统计在成熟期8月底测定。用内径2 cm的土钻取0~10 cm深的混合样土样，于4℃冰箱保藏。
2.2.5. 土壤可培养微生物数量测定
采用稀释平板法分离土壤中的细菌、放线菌、霉菌和酵母菌，并加以计数。分离细菌用牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌用高氏1号培养基，真菌(霉菌和酵母菌)用马丁氏培养基，在马丁氏培养基上培养的菌落总数计数为真菌，将丝状菌形成菌落计为霉菌，将非丝状菌计数为酵母，真菌数量为霉菌与酵母菌之和 [12] [13] 。
细菌和真菌数量的比值B/F的计算公式：B/F = 土壤中细菌数量/土壤中真菌数量。
2.2.6. 土壤酶活性的测定
脲酶用苯酚钠比色法。过氧化氢酶活性的测定采用高锰酸钾滴定法。酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定 [14] 。
2.2.7. 半夏生长量测定及发病率统计
测定指标如下：
1) 半夏株高，茎叶重、茎粗、叶面积：每盆5株全部测定。直尺测量株高，电子天平秤茎叶重，叶面积仪仪测定叶面积，游标卡尺测定茎粗。
2) 半夏繁殖系数；以大于1.0 cm的块茎计数，繁殖系数 = 采收的块茎数/播种块茎数。
3) 半夏块茎腐烂病统计：以发病率统计：感病块茎数除以采收的块茎数除以百分数表示。
2.3. 数据处理
采用SPSS13.0与Excel2010软件进行方差分析和显著性检验。
3. 结果与分析
3.1. 土壤细菌、放线菌、真菌数量分析
3.1.1. 田间不同处理对土壤微生物数量影响
从表1中可以看出，与对照比较，两种处理均能使土壤细菌、放线菌、微生物总数和B/F值升高，真菌数量下降；其中，浇灌处理与浓度有关，高浓度效果更加明显。当加入50 mg/ml时细菌升高了2.55%，放线菌增加了2.94%，真菌数量减少了3.67%，微生物总量增加3.77%，B/F值增加4.25%；高浓度80 mg/ml时变化较明显。细菌增加了6.59%，放线菌增加了5.45%，真菌数量减少了7.95%，微生物总量增加5.79%，B/F值增加8.49%。间作处理细菌数量增加5.40%，放线菌增加4.61%，真菌减少10.09%，微生物总数增加5.11%，B/F值增加9.43%。
Table 1. Effects of field different treatment on soil microbial community
表1. 田间不同处理对土壤微生物区系的影响
注：处理间数据比较，不同字母表示在0.05水平上差异显著。下同。
3.1.2. 盆栽不同处理对土壤微生物数量影响
从表2中可以看出，与对照比较，两种处理均能使土壤细菌、放线菌、微生物总数和B/F值升高，真菌数量下降；其中，浇灌处理与浓度有关，高浓度效果更加明显。当加入50 mg/ml时细菌升高了3.34%，放线菌增加了4.52%，真菌数量减少了6.52%，微生物总量增加4.93%，B/F值增加5.07%；高浓度80 mg/ml时变化较明显。细菌增加了6.09%，放线菌增加了6.57%，真菌数量减少了10.25%，微生物总量增加9.05%，B/F值增加8.76%。间作处理细菌数量增加6.39%，放线菌增加6.16%，真菌减少9.63%，微生物总数增加7.99%，B/F值增加9.68%。
Table 2. Effects of field different treatment on soil microbial community
表2. 盆栽不同处理对土壤中微生物区系的影响
3.2. 土壤主要酶活性变化
3.2.1. 田间不同处理对根系土壤酶活性影响
田间处理后土壤中三种酶含量与对照相比均有所变化(表3)。其中用带菌黑麦草种子浸提液处理后，脲酶的含量随着浓度的增加有下降趋势，当浓度为50 mg/ml 时下降5.03%，80 mg/ml时升高15.72%；而过氧化氢酶含量在50 mg/ml时下降2.66%，80 mg/ml时上升了3.32%，酸性磷酸酶含量在浓度为50 mg/ml时下降了1.64%，在80 mg/ml时上升了5.51%。与对照相比，间作处理后土壤脲酶含量下降13.84%，过氧化氢酶和磷酸酶含量分别升高3.65%和3.95%。
Table 3. Effects of field different treatment on soil enzyme activities
表3. 田间不同处理对根系土壤酶活性影响
3.2.2. 盆栽不同处理对根系土壤酶活性影响
盆植处理后土壤中三种酶含量与对照相比变化如下表(表4)。用带菌黑麦草种子浸提液处理后，脲酶的含量随着浓度的增加有下降趋势，当浓度为50 mg/ml时下降8.55%，80 mg/ml时下降了17.11%；而过氧化氢酶和酸性磷酸酶含量出现了低浓密度下降高浓度升高的的现象，与对照相比，50 mg/ml时过氧化氢酶下降7.72%，80 mg/ml时上升了6.43%，酸性磷酸酶含量在浓度为50 mg/ml时下降了2.62%，在80 mg/ml时上升了6.13%。间作后土壤脲酶含量降低8.55%，过氧化氢酶含量和酸性磷酸酶含量分别升高了分别8.36%和5.01%。
3.3. 半夏主要生长变化
3.3.1. 田间不同处理对半夏生长的影响
与对照相比，田间两种处理半夏主要生长指标及发病率均有明显变化。间作处理时，株高增加了10.31%，叶面积增加了9.63%，茎叶重增加了9.35%，繁殖系数提高了16.84%，发病率下降了56.43%。浇灌处理时，50 mg/ml带菌黑麦草种子浸提液对半夏苗地上部生长均产生不同程度的抑制作用，与对照比较，株高下降5.42%，叶面积下降4.93%，茎叶重下降5.61%，但繁殖系数提高了8.42%，块茎腐烂病发病率下降了56.84%；浓度为80 mg/ml对半夏田间苗地上部和地下部生长均产生不同程度的促进作用，其中株高增加了9.75%，叶面积增加了6.85%，茎叶重增加了11.21%，繁殖系数升高了18.95%，块茎腐烂病发病率下降了62.82% (表5)。
Table 4. Effects of pot different treatment on soil enzyme activities
表4. 盆栽不同处理对根系土壤酶活性影响
Table 5. Effects of field different treatment on P. ternata yield
表5. 田间不同处理对半夏生长的影响
3.3.2. 盆栽不同处理对半夏生长的影响
与对照相比，盆栽时两种处理半夏主要生长指标及发病率均有变化。间作处理时，株高增加了11.09%，叶面积增加了11.09%，茎叶重增加了10.71%。繁殖系数升高17.82%，发病率下降了76.74%。浇灌处理时，50 mg/ml带菌黑麦草种子浸提液对半夏苗地上部生长均产生不同程度的抑制作用，其中，株高下降了7.17%，叶面积下降5.02%，茎叶重下降8.04%，而繁殖系数升高了10.89%，块茎腐烂病发病率下降了60.87%；浓度为80 mg/ml对半夏盆栽苗地上部和地下部生长均产生了不同程度的促进作用，其中株高增加了12.12%，叶面积增加了11.61%，茎叶重增加了12.50%，繁殖系数升高了19.80%，块茎腐烂病发病率下降了75.56% (表6)。
Table 6. Effects of pot differenttreatment on P. ternata yield
表6. 盆栽不同处理对半夏生长的影响
4. 结论
内生真菌是生长于植物组织的细胞间，不表现出感染症状的一类真菌 [15] [16] 。它分布于植物的叶鞘、种子、花、茎、叶和根中，与植物的关系是互惠共生的，一方面植物为内生真菌提供光合产物， 另一方面内生真菌的代谢产物能刺激植物的生长发育，提高宿主植物对生物胁迫与非生物胁迫的抵抗能力，如促进植物生长、增加分蘖数、增强植物体内保护酶系统、抗病虫害等 [16] [17] 。本研究结果表明，带菌黑麦草与半夏间作或用其种子浸提液处理均在一定程度上改变了土壤微生物群落结构，使土壤微生物结构从“真菌型”开始向“细菌型”转化，生物多样性增强，这种转化有利于作物生长。而且浸提液处理的土壤微生物变化与处理浓度有一定关系，随着浸提液量的增加和生长时间的延长，半夏生长根际土壤中微生物活动开始朝细菌、放线菌和总微生物数量升高、真菌数量降低的方向发展。这些差异的出现，分析其原因，可能与黑麦草化感作用或与带菌黑麦草内生真菌有关。
土壤酶是土壤物质循环和能量流动的主要参与者，是土壤生态系统中最活跃的组分，推动土壤有机质的矿化分解和土壤养分的循环与转化，其活性可反映土壤养分转化能力的强弱，是维持土壤肥力的一个潜在性指标。本研究两种处理中脲酶含量均出现了下降，而过氧化氢酶和酸性磷酸酶则出现了差异。间作处理后两种酶活性都有所升高。而浇灌处理与添加浓度有关系，较高浓度促进其活性，较低浓度抑制其活性。酸性磷酸酶含量和过氧化氢酶含量升高均有利于半夏生长。这些说明带菌黑麦草化感物质或内生真菌次生代谢物与土壤酶活性有一定的关系。
本试验结果也证实，用带菌黑麦草和半夏间作或浇灌带菌黑麦草种子浸提液均能有效改善半夏生长状况，其中，浸提液处理效果受浓度影响较大，高浓度效果较低浓度更加明显。间作处理对半夏地上部生长的促进作用效果没有浇灌处理明显，这可能是因为地上生长量是在半夏旺盛生长期采集，半夏与带菌黑麦草间作后时间不长，内生真菌及其黑麦草次生代谢物量产生较少，对半夏根际分泌物影响不大，但随着生长时间延长，两种处理半夏繁殖系数和块茎腐烂病发病率下降都比较明显。这与本试验两种修复措施中土壤真菌含量较少，细菌含量增多相一致。目前很多学者认为，对植物土传病害的抑制在一定程度上是土壤微生物群体的作用，通过它们对病原菌的拮抗作用抑制或直接杀死病原菌的菌丝及孢子，当微生物群落结构越丰富，物种越均匀，多样性越高时，对抗病原菌的综合能力就越强。本研究中两种处理方式均能有效克服连作障碍带来的生长副作用，使土壤环境朝着有益于生长的方向发展。但至于是黑麦草的化感作用亦或是内生真菌的抗逆性起主要作用目前还不清楚，有待于进一步验证。
基金项目
甘肃省高等学校科研项目(2015B-153)；天水市科技支撑计划项目。