1. 引言

生命系统的功能性和完整性离不开酶的催化作用，提高酶的活性和稳定性是工业经济发展以及药物医学研究的必然要求。大量文献表明阳离子表面活性剂能够提高酶的催化效率[1]，近年来，Gemini型表面活性剂由于其具有更好的物理化学性质以及更多的实际应用需要被认为是比较有潜力的研究对象。α-糜蛋白酶在医学治疗方面也具有重要意义，比如手术后的伤口愈合以及消炎和防止局部水肿等等。在这篇文章中，我们研究了gemini型表面活性剂在稀溶液状态时与α-糜蛋白酶的相互作用，诱导α-糜蛋白酶出现超活性提高催化效率必将具有非凡的意义和价值。

Gemini型表面活性剂分子具有两组极性头基和两条疏水烷基链，这两部分由间隔链(spacer)在头基处共价相连，由于其二聚体结构，它们表现出较低的临界胶束浓度，较强的表面张力降低能力以及较好的增溶能力被认为是一类新型的表面活性剂[2]，除了良好的物理化学性质，gemini型表面活性剂还可以作为添加剂在防腐剂，护发素，以及对皮肤和眼睛无刺激的个人护理中有良好的应用[3]，由于其显著的化学性质和广泛的应用，近年来关于gemini表面活性剂与酶的相互作用研究层出不穷。

α-糜蛋白酶(α-CT)是一种被广泛研究的丝氨酸蛋白酶，具有众所周知的结构和作用机理，它可以催化蛋白质中肽键的水解，也能够作用于小的酰胺和酯[4]-[6]。α-CT的分子量为24,800，是一种尺寸为40 × 40 × 51 nm³的球形蛋白，也可以近似的看作半径为22 nm的球体[7]。α-糜蛋白酶在PH = 3的溶液中为单体–二聚体平衡的结构，而在PH = 7的溶液下是以单体–六聚体平衡的形式存在[8]。一个α-CT分子有八个色氨酸残基，其中两个(Trp-27和Trp-29)掩埋在分子的内部区域，有四个氨基酸(Trp-51、Trp-141、Trp-172和Trp-215)暴露面积低于酶分子总表面积的20%，而另外两个色氨酸残基(Trp207)和(Trp237)暴露于溶剂中的面积分别为46%和49% [9]。α-CT的活性位点由组氨酸-57，丝氨酸-195和天门冬氨酸-102组成[10]，活性位点与酶的催化活性密切相关。许多文献将α-CT选为模型酶来研究表面活性剂对球蛋白活性和稳定性的影响[11]。

2. 实验部分

2.1. 实验试剂

本实验中使用的商品试剂均为分析纯，具体试剂详见表1，本实验中的季铵盐型双子(gemini型)表面活性剂(12-s-12，s = 2、6和10)按照文献的方法在本实验室制备[12]，纯度 > 99.0%，所有合成12-s-12所用的试剂均为分析纯。

实验中需要的磷酸盐缓冲溶液(PBS)由二次去离子水(电导率1.2 × 10⁻⁶ S∙cm⁻¹)配制而成，采用双重纯水蒸馏器(SZ-93，上海亚荣生化仪器厂)蒸馏获得，称量NaHPO₄∙12H₂O和NaH₂PO₄∙2H₂O的质量分别为1.0335 g和0.3301 g定容于500 mL容量瓶中，得到10 mmol∙L⁻¹ (PH = 7.3)的缓冲溶液。实验中如没有特别说明缓冲溶液的浓度，均为10 mmol∙L⁻¹的PBS。

Table 1. Test drugs (agents) required for the experiment

表1. 实验所需试剂

2.2. 实验方法

α-糜蛋白酶的活性是通过底物乙酸-2-萘酯在磷酸缓冲溶液中的水解速率进行评估测定的。通过使用TU-1900双光束紫外可见分光光度计得到在分解产物2-N在最大吸收波长(328 nm)下吸光度随时间的变化曲线，再将其转换为2-N的浓度随时间的变化曲线，由曲线初始线性部分的斜率来表征α-CT的活性，具体可见图1。

活性测量实验中，α-糜蛋白酶储备液避光保存30 min后使用，底物2-NA溶解于乙二醇中，同时采用超声震荡加速溶解30 min，由于加入的乙二醇的体积分数非常低，为3% (V_乙二醇/V_总)，并且已经有文献证明，具有与乙二醇相似结构的甘油不会改变缓冲溶液中α-CT的构象[13]，因此乙二醇的存在不会影响酶活性的测量。活性测量时温度恒定为25℃，测定温度由低温恒温槽控制。

实验前先打开恒温槽、紫外可见分光光度计和紫外分析软件各预热15 min，选择时间扫描光度模式，波长设定为328 nm，扫描方式选择单次扫描。实验开始前进行空气校零，然后分别向两个3 mL的比色皿中加入等体积的缓冲溶液、表面活性剂溶液和α-CT溶液，充分混合后放入比色皿槽内恒温避光保存10 min，避光放置后进行光度校零，然后向样品池中加入2-NA溶液，即可开始活性测量。

参比池除了不含有底物2-NA以外，其他实验条件均与样品池相同。实验得到的328 nm下2-N吸光度随时间的变化规律可以通过消光系数ε₃₂₈ = 1.53 × 10³ L∙M⁻¹∙cm⁻¹ [14]处理得到2-N的浓度随时间的变化曲线。

3. 结果与讨论

3.1. 阳离子Gemini表面活性剂对α-糜蛋白酶超活性的影响

活性实验中，α-糜蛋白酶水解底物2-NA生成产物2-N，在328 nm下测量2-N的吸光度随时间的变化，单次扫描10 min，得到2-N吸光度随时间的变化曲线。通过2-N在328 nm下的消光系数ε₃₂₈ = 1.53 × 10³ L∙M⁻¹∙cm⁻¹转化为浓度随时间的变化曲线，如图1所示，再由曲线的斜率得到α-CT的水解速率。在表面活性剂存在下α-CT的水解速率除以在缓冲溶液中的速率，即可得到相对活性。

Figure 1. At 298.15 K, variation of the concentration of 2-N obtained by catalyzing substrate hydrolysis of α-CT after 10 minutes of cultivation in 12-10-12 with time, the slope of the curve represents the decomposition rate of α-CT. The 12-10-12 concentrations in the direction of the arrow in the figure are: 0.005 mmol∙L⁻¹, 0. 01 mmol∙L⁻¹, 0.04 mmol∙L⁻¹

图1. 在298.15 K时，α-CT在12-10-12中培养10 min后催化底物水解得到产物2-N的浓度随时间的变化曲线，曲线的斜率代表α-CT的分解速率。图中随着箭头方向12-10-12的浓度依次为：0.005 mmol∙L⁻¹，0. 01 mmol∙L⁻¹，0.04 mmol∙L⁻¹

Figure 2. At 298.15 K, the enzyme was incubated 10 min in the surfactant solution before 2-NA was added to trigger the enzymatic reaction. Variation of the relative activity (v_r) of α-CT with concentration of: C₁₂C₂C₁₂Br₂ (ρ), C₁₂C₆C₁₂Br₂ (≤), C₁₂C₁₀C₁₂Br₂ (○) and DTAB (σ, top abscissa), respectively. The solid symbols represent the cmc locations corresponding to the surfactants expressed by the open symbols with the same shapes, respectively

图2. 在298.15 K时，α-CT在表面活性剂12-s-12中培养10 min后其相对活性随着12-s-12浓度的变化曲线。图中实心符号分别表示各自表面活性剂对应的cmc位置，v_r表示α-CT在表面活性剂存在下催化2-NA水解的初始速率与没有表面活性剂时的初始速率的比值。C_i分别表示12-2-12 (△)；12-6-12 (≤)；12-10-12 (○)；DTAB (▽，顶部横坐标)

图2为0.10 g∙L⁻¹ α-CT在表面活性剂12-s-12 (s = 2、6和10)或DTAB中培养10 min后水解0.081 mmol∙L⁻¹ 2-NA的相对活性变化曲线。结果显示，12-s-12/α-CT或DTAB/α-CT体系在各自低浓度区(表面活性剂的临界胶束浓度以下)域均存在α-CT的超活性(v_r > 1)，在某一浓度下达到相对活性的最大值，之后随着表面活性剂浓度的增加，相对活性逐渐减小。从图2中可以得到12-s-12 (s = 2、6和10)和DTAB的最大相对活性，分别为v_r,max = 1.2、1.35、1.5和1.2，不难发现α-CT的相对活性与gemini表面活性剂的spacer长度正相关，即随着spacer长度的增加，相对活性逐渐增加，这一现象与已有文献关于spacer长度对酶活性和结构的影响表现出相似性[3] [15]。这个结果同样也吻合了表面活性剂阳离子头基的疏水性或尺寸大小可以调控α-CT活性的结论[4] [16] [17]。

另一方面，gemini型表面活性剂的电荷密度会随着spacer长度的增加而减小，当spacer足够长时，电荷密度会减小到一个比较小的值，类似于单链的阳离子表面活性剂的电荷密度。DTAB/α-CT体系在这里作为对比，因为DTAB的阳离子头基类似于gemini型表面活性剂头基的一部分，并且DTAB与α-CT的相互作用已经被很好的研究[18]。实验中DTAB/α-CT体系所得到的最大相对活性比12-s-12/α-CT体系低，说明单链的DTAB与含有共价连接基团的gemini型表面活性剂相比对α-CT具有不同的相互作用。

3.2. 缓冲溶液浓度对α-糜蛋白酶活性的调控

为了进一步探究具有不同spacer长度的表面活性剂12-s-12 (s = 2、6和10)其头基的电荷密度对α-CT活性的影响，我们尝试通过部分中和表面活性剂头基的电荷来改变头基的电荷密度，即引入无机盐反离子或带负电的表面活性剂。PH = 7.3的磷酸盐缓冲溶液，应用于所有的细胞质中，其中${\text{H}}_2{\text{PO}}_4^{-}$ 作为质子供体，${\text{HPO}}_4^{2-}$ 作为质子受体：

${\text{H}}_2{\text{PO}}_4^{-}\rightleftarrows {\text{H}}^{+}+{\text{HPO}}_4^{2-}$ (1)

并与阳离子表面活性剂能达到同时平衡：

${\text{HPO}}_4^{2-}+\text{R}{\left({\text{CH}}_3\right)}_3{\text{N}}^{+}\rightleftharpoons {\left(\text{R}{\left({\text{CH}}_3\right)}_3{\text{N}}^{+}{\text{HPO}}_4^{2-}\right)}^{-}$ (2)

在这个体系中，我们直接忽略阳离子表面活性剂与${\text{H}}_2{\text{PO}}_4^{-}$ 的相互作用。公式(2)中描述的反应可以通过由缓冲溶液配制的表面活性剂溶液滴入相应浓度的缓冲溶液的电导率的变化来证实，如图3，当增大缓冲溶液浓度时，磷酸根阴离子与阳离子表面活性剂之间的静电作用增强，导致表面活性剂的电导率值先减小后增加，同时也进一步说明增大缓冲溶液浓度是可以削弱表面活性剂头基的电荷密度的。

图4为0.10 g∙L⁻¹ α-CT在表面活性剂存在下的相对活性随缓冲溶液浓度的变化曲线。对于12-s-12/α-CT体系，其最大相对活性所对应的缓冲溶液浓度与12-s-12的spacer长度有关，即10 mmol∙L⁻¹，50 mmol∙L⁻¹ 和60 mmol∙L⁻¹分别对应于12-10-12，12-6-12和12-2-12，这一规律与表面活性剂头基电荷密度的增加顺序一致。作为对比的DTAB/α-CT体系，在缓冲溶液浓度达到40 mmol∙L⁻¹时出现α-CT的最大相对活性。

从这个结果，我们可以认为12-s-12头基电荷密度的削弱在一定程度上有利于激活α-CT，具有较短间隔链长度的表面活性剂，或者说，具有较大电荷密度的表面活性剂在较高浓度缓冲溶液的调控下更有利于得到较高的相对活性。具有不同spacer长度的表面活性剂对α-CT活性具有不同的影响也可以从头基的尺寸以及疏水性来解释[4] [16]，即表面活性剂头基的尺寸越大，头基的电荷密度相对越低，导致表面活性剂与α-CT之间的静电作用越弱。

另一方面，对于表面活性剂头基的疏水作用似乎是不确定的，因为我们还不能证明疏水的亚甲基间隔链是否插入了酶的疏水区域。如果我们假设连接两个头基的spacer与α-CT负电荷周围的疏水残基间的疏水作用是明显的，那么这就会缩短带正电的表面活性剂与带负电的α-CT之间的距离，从而增强它们之间的静电作用，但这将与之前讨论的电荷密度影响或头基的尺寸效应等结论相互矛盾。

Figure 3. Variation of the conductivity (Δκ) of: (I) C₁₂C₂C₁₂Br₂, (II) C₁₂C₆C₁₂Br₂, (III) C₁₂C₁₀C₁₂Br₂ and (IV) DTAB with concentration of phosphate buffer at 298.15 K. The different symbols in the figure represent the concentrations of buffer solutions respectively: (■) 10 mmol∙L^–1; (●) 30 mmol∙L^–1; (▲) 50 mmol∙L^–1; (▼) 70 mmol∙L^–1. The pH value of all the buffer solution with different concentration is 7.3

图3. 在298.15 K时，四种阳离子表面活性剂的电导率值随着缓冲溶液浓度的变化曲线：(I) 12-2-12；(II) 12-6-12；(III) 12-10-12；(IV) DTAB。图内不同的符号分别表示缓冲溶液的浓度：(■) 10 mmol∙L^–1；(●) 30 mmol∙L^–1；(▲) 50 mmol∙L^–1；(▼) 70 mmol∙L^–1。所有浓度缓冲溶液PH = 7.3

Figure 4. At 298.15 K, variation of the relative activity (v_r) of 0.10 g∙L^–1 α-CT with concentration of phosphate buffer. The symbols indicate the surfactants: (▲) C₁₂C₂C₁₂Br₂ of 0.07 mmol∙L^–1, (●) C₁₂C₆C₁₂Br₂ of 0.08 mmol∙L^–1, (○) C₁₂C₁₀C₁₂Br₂ of 0.04 mmol∙L^–1, (σ) DTAB of 6 mmol∙L^–1 and (ν) pure phosphate buffer, respectively. The concentrations of the other components were constant 0.081 mmol∙L^–1 2-NA and 3(v/v)% glycol, respectively. The incubation time of α-CT was 10 minutes before 2-NA was added in all the experiments

图4. 在298.15 K时，0.10 g∙L⁻¹ α-CT的相对活性随着缓冲溶液浓度的变化曲线。不同符号分别表示：(▲) 0.07 mmol∙L⁻¹的12-2-12，(●) 0.08 mmol∙L^–1的12-6-12，(○) 0.04 mmol∙L^–1的12-10-12，(σ) 6 mmol∙L^–1的DTAB以及(■)缓冲溶液。实验中，底物2-NA的浓度为0.081 mmol∙L⁻¹，乙二醇的含量为3% (v/v)，所有实验的培养时间均为10 min

为了进一步确认α-CT相对活性随着缓冲溶液浓度的变化主要来源于表面活性剂电荷密度的改变而不是简单地PBS影响，我们做了0.10 g∙L⁻¹ α-CT在纯磷酸盐缓冲溶液中的活性(见图4，虚线以下)。α-CT在10~70 mmol∙L⁻¹的缓冲溶液中的相对活性总体变化不大，其中相对活性最低达到90%，说明高浓度的磷酸缓冲溶液本身对α-CT的活性仅有微弱的影响。

4. 结语

12-s-12/α-CT (s = 2、6和10)或DTAB/α-CT体系在各自低浓度(临界胶束浓度以下)区域均存在α-CT的超活性(V_r > 1)，其中12-s-12 (s = 2、6和10)的催化效果比单链DTAB要好。α-CT相对活性的大小与gemini型表面活性剂的间隔链长度有关，即spacer越长，头基的电荷密度相对越小，超活性出现得越早而且最大相对活性值也越高。通过改变磷酸盐缓冲液的浓度来调控α-CT活性。磷酸盐抗衡离子与表面活性剂阳离子之间的非共价静电缔合会降低表面活性剂头基的平均电荷密度，因此将会改变表面活性剂对α-CT相对活性的影响。

参考文献