1. 引言

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, KP)是一种肠杆菌科克雷伯菌属革兰阴性杆菌，同时也是一种条件致病菌，常见于环境(如水、土壤等)以及动物黏膜表面。在前抗生素时代，肺炎克雷伯菌是社区获得性肺炎的重要病原体，随着抗生素的出现及广泛应用，它已成为医院获得性感染的主要原因[1]。肺炎克雷伯菌根据其毒力水平可分为经典型肺炎克雷伯菌(classical K. pneumoniae, cKP)和高毒力型肺炎克雷伯菌(hypervirulent K. pneumoniae, hvKP)。与cKP相比，hvKP菌株通常表现出较强的抗菌特性，导致侵袭性感染如肝脓肿等[2]。本次研究所用的菌株NTUH-K2044是高毒力型肺炎克雷伯菌，具有高毒力和高黏性的特征，能够形成生物膜。

生物膜是包裹在胞外聚合物中的复杂微生物群落，它表现出对经典抗生素耐药性的提高并附着在医疗器械或非器械(组织)中造成感染引起疾病，对全球人类健康问题构成威胁[3]。生物膜基质主要由胞外多糖、外源DNA、蛋白质和脂质构成[4]。另外生物膜的形成主要分为附着、粘附、胞外聚合物质的分泌、形成菌落生物膜成熟、细菌逃逸分散形成新的生物膜5个阶段[5]。细菌的生物膜一旦形成，它对外界环境中有害因子的抵抗力将大大增强，抑制其生长的抗生素浓度比没有形成生物膜时的状态要高10~1000倍[6] [7]。有研究表明细菌的菌毛结构可以介导细菌粘附到外界表面以形成生物膜[8]，KP生物膜的形成基础就是I型和III型菌毛介导的粘附作用，编码这些菌毛粘附特性的基因簇为fim和mrk [9]。I型菌毛主要由结构亚基fimA和少量辅助亚基fimK等以及甘露糖特异性粘附素fimH组成，fimH可介导甘露糖敏感性结合靶宿主细胞引起膀胱炎造成尿路感染，而fimK则主要表达菌毛尖端的粘附蛋白以此来发挥I型菌毛的粘附作用[10] [11]。III型菌毛的结构亚基为mrkA，其粘附性主要由mrkD和mrkH基因来表达[12]。而且似乎在KP生物膜的形成过程中III型菌毛基因簇mrk更为重要，尤其是mrkD，III型菌毛的表达能够强烈促进生物膜的形成[13]。除了菌毛在生物膜的形成过程中发挥重要作用外，细菌的荚膜多糖成分对生物膜的形成也很重要，调节荚膜多糖表达的rmpA基因与KP的高黏表型有关，rmpA的高表达促使KP的荚膜多糖分泌增多从而呈现出高黏表型。毒力因子magA也是一种KP黏液相关基因，这两个基因的高表达均能显著增加KP的黏性使之能更容易附着在物体表面形成生物膜。

灵菌红素(Prodigiosins, PG)是一种粘质沙雷氏菌和其他革兰氏阴性菌的天然次级代谢产物，通常都有3个吡咯环组成的甲氧基吡咯骨架结构，具有抗癌、抗疟、抗细菌、抗真菌和抗原虫等多种生物学活性[14]。PG在抗细菌方面有着提取纯化步骤简单和低毒性等优点，而且有研究证明PG对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌等致病菌有良好的抗菌活性[15]。同时PG对金黄色葡萄球菌还有着良好的抗生物膜作用[16]，但目前PG是否能影响KP生物膜的形成及其影响的机制尚不清楚。本研究通过测定PG对KP的最小抑菌浓度(MIC)、最小生物膜抑制浓度(MBIC)、I型和III型菌毛基因以及荚膜多糖基因、毒力基因的表达等，初步探讨PG对KP生物膜的影响及其机制，以期为PG抗KP生物膜相关感染提供理论依据。

2. 材料与方法

2.1. 主要仪器与试剂

KP NTUH-K2044菌株(实验室保存)，灵菌红素(实验室保存)，LB液体、固体培养基，MH液体培养基，结晶紫溶液，5xPrimeScript^TMRT Master Mix (Takara)，TB Green® Premix Ex TaqTM II (Takara)，Simply P总RNA提取试剂盒(BioFlux)，生化培养箱(龙跃)，PCR仪(T100^TMThermal Cycler, BIO-RAD)，实时荧光PCR仪(CFX Connect^TM, BIO-RAD)。

2.2. 方法

(1) 测定灵菌红素对KP的最小抑菌浓度方法参考临床和实验室标准协会M100-S28。从24 h培养的LB平板上挑取3~4个菌落在生理盐水中制成0.5麦氏浊度的菌液，用MH肉汤将菌液稀释100倍。用MH肉汤将灵菌红素稀释到2048 ug/ml备用。在96孔板各孔中加入50 ul灵菌红素，然后倍比稀释，使每孔浓度依次为1024、512、256、128 ug/ml。各孔加入稀释后的菌液50 ul，使每孔溶液的体积都为100 ul。加入菌液后，每孔灵菌红素的浓度为512、256、128、64 ug/ml。阴性对照加入等体积的乙醇溶液，LB液体培养基为空白对照。37℃培养16~20 h，肉眼观察孔中无细菌生长的药物浓度为MIC。

(2) 结晶紫染色法测定灵菌红素对KP生物膜的最小抑制浓度将KP用LB液体培养基培养到对数生长期(OD600约0.5)，用LB液体培养基稀释100倍。将稀释后的菌液加入96孔板中，实验组加入终浓度为1/2 MIC、1/4 MIC、1/8M IC的灵菌红素，对照组加入等体积的无水乙醇(排除溶剂的干扰)。在37℃培养24 h后，吸除培养液，用PBS缓缓洗涤3次以除去浮游菌，然后加入100 ul甲醇固定15 min，吸除后再加入100 u l0.1%的结晶紫染色10 min，吸除结晶紫并用PBS清洗两次除去未与生物膜结合的结晶紫，最后加入100 ul33%乙酸，用酶标仪测定在570 nm处吸光度。

(3) 生长曲线将培养到对数生长期的菌液稀释后加入蜂窝板中，并加入灵菌红素，使每孔灵菌红素的浓度为1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC。阴性对照加入无水乙醇来排除溶剂的影响。最后将蜂窝板放入微生物增长分析仪，37℃培养24 h，每2 h测定一次OD600。

(4) RT-PCR检测将细菌培养到对数生长期，分别在1 ml菌液中加入1/4 MIC和1/8 MIC的灵菌红素；外加阴性对照和空白对照，阴性对照加入等体积的乙醇溶液。振摇混匀后于37℃培养12 h和24 h。使用试剂盒提取细菌总RNA，用5xPrimeScript^TMRT Master Mix将RNA逆转录为cDNA。设计KP生物膜形成相关基因引物，16SrRNA为内参基因，按2^−ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。引物见表1。

Table 1. Primers for KP biofilm-related genes

表1. KP生物膜相关基因引物

2.3. 统计学方法

数据分析用GraphPad Prism9.5.1软件，组间多重比较用到的统计学方法是单向方差分析(ANOVA)，P < 0.05认为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 灵菌红素对KP的MIC值

结果显示，当灵菌红素浓度为512 ug/ml和256 ug/ml时，MH液体培养基中无细菌生长；当灵菌红素浓度在256 ug/ml以下时，MH液体培养基中细菌生长。即灵菌红素对KP的MIC值为256 ug/ml。

3.2. 灵菌红素对KP生物膜的最小抑制浓度

培养24 h后，各组生物膜都有不同程度的生长。与对照组相比，灵菌红素浓度越高对KP生物膜的抑制作用越大，1/4 MIC组和1/2 MIC组的生物膜形成量均下降且差异具有统计学意义(P < 0.05)。其中1/4 MIC是灵菌红素抑制KP生物膜形成的最小浓度即MBIC。见图1。

注：与对照组比较，^nsP > 0.05，^*P < 0.05，^***P < 0.0005。

Figure 1. The formation of KP biofilm under different concentrations of prodigiosin

图1. 不同浓度灵菌红素作用下KP生物膜的形成量

3.3. 生长曲线

为了进一步确定灵菌红素对KP的抑制作用，构建生长曲线来评估KP在1/2 MIC浓度到1/8 MIC浓度下48 h内的生长情况。结果显示，与对照组相比，不同浓度的灵菌红素都会抑制KP的生长，灵菌红素浓度越高对KP的生长抑制作用越大。见图2。

Figure 2. Growth curves of KP under different concentrations of prodigiosin

图2. KP在不同浓度灵菌红素下的生长曲线

3.4. 灵菌红素对KP生物膜相关基因表达的影响

培养12 h后，与对照组相比，KP I型和III型菌毛基因fimA、mrkD、mrkH的表达量受到1/4 MIC灵菌红素的抑制作用，1/8 MIC灵菌红素则对这三个基因的表达量无抑制作用；fimH、fimK的表达量受到不同浓度灵菌红素的抑制作用，且抑制作用随浓度的升高而加大。但mrkA基因的表达量不受灵菌红素的影响。KP荚膜多糖基因rmpA和毒力基因magA也受到不同浓度灵菌红素的抑制作用，且抑制作用随浓度的升高而加大。见图3。

注：与对照组相比，^nsP > 0.05，^**P < 0.05，^***P < 0.0005，^****P < 0.0001。

Figure 3. The effect of different concentrations of prodigiosin on the expression of KP biofilm-related genes (12 hours)

图3. 不同浓度灵菌红素对KP生物膜相关基因表达量的影响(12 h)

注：与对照组相比，^nsP > 0.05，^**P < 0.05，^***P < 0.0005，^****P < 0.0001。

Figure 4. The effect of different concentrations of prodigiosin on the expression of KP biofilm-related genes (24 hours)

图4. 不同浓度灵菌红素对KP生物膜相关基因表达量的影响(24 h)

培养24 h后，与对照组相比，KPI型和III型菌毛基因表达量(除fimA基因外)均受到灵菌红素的负向调控作用。KP荚膜多糖基因rmpA的表达量不受不同浓度灵菌红素的影响，毒力基因magA的表达量则受到不同浓度灵菌红素的负向调控作用。见图4。

4. 讨论

KP是一种重要的条件致病菌，对多种抗生素具有耐药性，时常威胁着人类健康。而生物膜是KP感染难以根除的重要原因，它为细菌的增殖、分散提供了帮助[18]。所以，探索抗KP感染的新疗法时，抑制生物膜的形成是一种新思路。目前灵菌红素作为一种广谱抗菌物质被广泛研究[19]，本研究测得灵菌红素对KP的MIC为256 ug/ml，说明灵菌红素对KP的生长有抑制作用。同时检测得到灵菌红素对KP生物膜的MBIC是其MIC的1/4，说明灵菌红素所引起的生物膜量减少是通过抑制生物膜的活性而不是菌体的活性达成的。这表明在临床应用时，灵菌红素并不会给KP带来过强的生存压力以致发生基因突变，从而减小产生耐药性的风险。

研究表明，灵菌红素对多种细菌都有抗生物膜活性作用，其抑制铜绿假单胞菌的生物膜活性机制主要为抑制细胞外多糖的产生以及下调有关生物膜形成的基因表达水平[20]。本研究中，结晶紫半定量实验结果显示，1/2 MIC和1/4 MIC浓度的灵菌红素对KP生物膜也有显著的抑制作用，且抑制作用随浓度增加而增加，说明灵菌红素能够抑制KP生物膜的形成。根据生物膜形成的五个阶段来看，随着时间的推移，成熟的生物膜开始分散，灵菌红素从最初抑制KP生物膜的活性开始转为抑制膜内细菌的生长活性，这体现在KP生长曲线在18 h左右开始下滑。

本研究中，用1/4 MIC和1/8 MIC浓度的灵菌红素处理KP菌体12 h后检测fimA、fimH、fimK、mrkA、mrkD、mrkH、rmpA、magA基因的表达量差异，发现1/ 4MIC这一浓度也就是MBIC对除了mrkA基因外的所有基因都有抑制作用，虽然灵菌红素并没有下调mrkA的水平，但III型菌毛的粘附作用主要是通过mrkD和mrkH来完成，灵菌红素均能显著下调这两者的水平，说明灵菌红素是可能通过抑制I型和III型菌毛从而来抑制KP生物膜的生长。但灵菌红素调控这些基因的具体机制还需进一步研究。有意思的是，当我们把灵菌红素的处理时间拉长到24 h时，相关基因的表达量反而会被上调或者保持不变，这可能与灵菌红素的活力有关或者与其浓度有关，在生长曲线上也能看出1/4 MIC和1/8 MIC这两个浓度的抑制作用会在24 h左右消失，其具体的原因有待进一步的研究发现。

5. 结论

综上所述，本研究发现灵菌红素能够有效抑制KP的生长和其生物膜的形成。其可能的是灵菌红素通过抑制mrkD、mrkH、fimA、fimH、fimK、rmpA以及magA等生物膜相关基因的表达，从而减少I型和III型菌毛的合成或粘附作用的产生，使生物膜的粘附能力下降，而表现出抗生物膜活性。本研究为阐明灵菌红素抗KP生物膜活性机制提供了线索，并为KP感染的治疗提供了新的思路。

NOTES

^*通讯作者。

参考文献