1. 前言

鳜(Siniperca chuatsi)，又称桂花鱼、翘嘴鳜等，隶属于鲈形目(Perciformes)、鮨科(Serranidae)、鳜属(Siniperca)。因其肉质细嫩、味道鲜美，少刺，深受广大消费者的喜爱，是一种经济价值极高的名贵水产品[1]。鳜鱼在我国南北方的自然分布都十分广泛，由于过去主要依靠从天然水域中捕捞获得，且具有吞食活饵的习性被视为凶猛敌害鱼类加以清除限制，致使该物种资源量逐年减少。到20世纪70年代，随着市场对高品质水产品需求的增加和饲料鳜等生产问题的解决，使得鳜鱼在90年代的广东[2]、江苏[3]、安徽[4]等地区逐步形成了规模化、专业化养殖格局。

近几年，受市场疲软、生产成本提高、大宗淡水鱼价格偏低等因素的影响，使本市以传统鲢鳙鱼为主的中小型养殖厂渔业效益十分低下。因此，很多养殖户都尝试着探索以鳜鱼养殖为主的渔业模式，希望借此趟出一条新的发展道路。本市养殖的鳜鱼苗种主要以广东、湖北、江苏等南方省份产的苗种为主，这就导致养殖过程中存在一些问题，比如南方鳜鱼不耐寒而导致的越冬成活率低，另外长途运输造成的鳜鱼苗种损伤，易发生应激及体表损伤等问题都影响着本市鳜鱼养殖生产活动[1]。而最为困扰养殖者的就是鳜鱼的病害问题，南方地区鳜鱼苗种病毒病携带率较高，种类较多，会伴随着跨省转运将一些病害传入本市并扩散蔓延，目前已经呈现出南方向北方扩展的流行趋势，给养殖户造成经济损失已成为事实。目前发现的鳜鱼病毒病常见病原主要有鳜鱼虹彩病毒、鳜鱼蛙病毒、传染性脾肾坏死病毒、弹状病毒、神经坏死病毒等，感染这些病毒的鳜临床症状相似，甚至与细菌感染性疫病临床症状也有类似，及时准确判断患病鳜的致病原成为养殖者的难题。对患病鳜致病原的错误认知，造成的药物滥用往往导致养殖者更加严重的经济损失，因此，确定致病原，同时控制好疾病的发生蔓延已经成为鳜鱼养殖能否成功的关键环节。

2023年8月，天津市滨海新区某鳜鱼养殖场发生了鳜鱼大批量死亡的情况，发病速度快，死亡率高，患病鳜鱼出现体表溃烂、漫游溜边等症状。本研究以该池塘患病鳜鱼为研究对象，开展了病原学鉴定和分析工作，旨在初步探索发病致病原，为本市鳜鱼养殖病害防控提供借鉴。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 患病动物

患病鳜采集自天津市滨海新区某养殖场土塘，平均体长约为20 ± 2.5 cm。

2.1.2. 试剂及仪器设备

主要试剂：海洋动物基因组提取试剂盒(天根)；Trizol (Invitorgen)；RT-PCR试剂盒、Premix Ex Taq、无酶水等均购自TaKara；营养琼脂、营养肉汤等购自北京陆桥；引物由英俊公司合成纯化；测序工作由上海生工完成。

主要仪器：高速冷冻离心机(艾本德)；PCR仪(ABI)；微量移液器(艾本德)；电泳仪(北京六一)；凝胶成像系统(伯乐)。

2.2. 方法

2.2.1. 患病鳜流行病学调查及临床症状观察

2023年8月，天津市滨海新区某鳜鱼养殖场发生了鳜鱼大批量死亡的情况，临床症状主要表现为患病与上浮、漫游溜边，部分鱼体色发黑。捞起病鱼观察体表出现溃烂的典型症状，溃烂部主要分布在腹部和尾鳍，鳃丝色浅缺血，且附有粘稠透明液体。流行病学调查结果显示：该鳜养殖池塘为土池，周边无其他鳜鱼养殖场，苗种采购于外省某鳜鱼苗种场，养殖时间约为80天，池塘水温约28℃，放养密度约为700尾/ m²，发病持续时间7天，累计死亡量50%以上，发病期间摄食量明显降低。使用过消毒剂、抗生素、益生菌及中草药，无缓解，病死鱼持续增多加重。

2.2.2. 寄生虫镜检

根据SN/T 2503-2010《淡水鱼中寄生虫检疫技术规范》[5]中水浸片显微镜检测方法进行患病鳜鳃丝、鳍条等部位寄生虫的检测，解剖挑取1~2条鳃丝和鳍条分别放置于载玻片上，向组织上滴2~3滴生理盐水后，迅速将盖玻片置于其上，排出气泡后放置显微镜下观察，并记录结果。

2.2.3. 细菌学分离鉴定

在无菌环境下用接种针分别挑取具有典型症状患病鳜的鳃丝、鳍条、腹水、肝脏、脾脏、肾脏、肠道等组织接种划线于营养琼脂平板，置于28℃培养48小时后，观察细菌生长情况，将具有生长优势的菌落分别划线，分离纯化3次后，挑取单菌落置于1 ml灭菌后的营养肉汤中进行过夜培养。待菌液生长至对数期，采用水煮法提取菌液基因组[6]，并使用16S r DNA通用引物对分离出的菌株DNA进行PCR扩增，上游引物序列为27 F：5’AGAGTTTGATCCTGG 3’，下游引物序列为1492 R：5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’。扩增的PCR产物送上海生工测序，测序结果通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)网站进行在线比对。

2.2.4. 病毒检测

将患病鳜的鳃丝、肝脏、脾脏和肾脏等组织解剖混合研磨成组织匀浆液，分别采用海洋动物基因组提取试剂盒和Trizol方法[7]提取匀浆组织的DNA和RNA，将提取好的RNA采用RT-PCR的方法反转录成出DNA，作为下列RNA病毒PCR扩增的模版，提取的DNA直接作为下列DNA病毒PCR扩增的模版。分别进行鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus, SCRV) [8]、神经坏死病毒(viral nervous necrosis, VNN) [9]、传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus, ISKNV) [10]和鳜鱼蛙病毒(mandarinfish ranavirus, MRV) [11]共4种鳜常见病毒病的检测后进行琼脂糖凝胶电泳，若在目标条带位置出现条带，将其进行割胶纯化后送往上海生工进行基因测序。

2.2.5. 阳性病原基因序列的比对及系统进化分析

将测序结果通过NCBI数据库中的BLAST程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行序列同源性分析，分别下载相关基因序列，通过Clustal x软件进行多重比对，采用MEGA 7软件中邻接法(neighbor joining, NJ)构建系统发育树(Bootstrap设置为1000次重复)，以确定致病原。

3. 结果与分析

3.1. 患病鳜的临床症状

患病鳜体色发黑，体表出现溃烂(图1(A))，鳃丝色浅缺血，分泌的大量透明黏液充满鳃腔(图1(B))，解剖后有黄绿色腹水流出，肠道严重水肿(图1(C))，肝脏贫血呈苍黄色(图1(D))。

Figure 1. Clinical symptoms of diseased mandarin fish collected from farms ((A): surface ulceration; (B): gill filaments filled with transparent mucus; (C): ascites and edematous intestines; (D): the liver appears pale yellow)

图1. 养殖场采集患病鳜临床症状((A)：体表溃烂；(B)：鳃丝充满透明黏液；(C)：腹水及水肿肠道；(D)：肝脏呈苍黄色)

3.2. 寄生虫观察

经制片和显微观察，患病鳜鳃丝、鳍条等部位均未观察到寄生虫，判断无寄生虫病感染。

3.3. 细菌分离鉴定

患病鳜鳃丝、鳍条、腹水、肝脏、脾脏、肾脏、肠道等组织接种于营养琼脂平板28℃培养48 h后，有少量细菌生长，无优势菌株。经纯化后，逐一挑取单菌落进行16SrDNA PCR扩增，扩增产物经测序和BLAST比对分析，结果显示，分离菌为乳酸菌属(Lactobacillus sp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)等益生菌类菌株，综合判断无细菌性致病原感染。

3.4. 病毒检测结果

琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示，所检测的4种鳜常见病毒性疫病中只有鳜鱼蛙病毒(MRV)在目标位置出现了条带，其大小为1392 bp，其他3种病原均未出现扩增条带，判断为阴性。将目标条带割胶纯化后的测序结果(GenBank No.: PQ212952.1)进行比对后显示，与NCBI数据库中与分离自大口黑鲈的虹彩病毒(LMBV-FS2021)主要衣壳蛋白基因(MCP) (GenBank No: ON418985.1)序列相似性度为100%，同时也与分离自大口黑鲈的蛙病毒(M2016)株全基因组中第96436位至97827位之间的核酸序列相似度为100%，因此推测该患病鳜感染病原为病毒性疫病，且致病原初步鉴定为虹彩病毒科蛙病毒属类的病毒。

Figure 2. Detection results of ranavirus in diseased mandarin fish (M: Marker; 1: Pathogen detection results in liver tissue of diseased mandarin fish; 2: Pathogen detection results in kidney tissue of diseased mandarin fish; B: Blank)

图2. 患病鳜蛙虹彩病毒检测结果(M：Marker；1：患病鳜肝脏组织病原检测结果；2：患病鳜肾脏组织病原检测结果；B：空白对照)

3.5. 系统进化树分析

系统进化树分析结果显示(图3)：扩增得到的患病鳜蛙病毒MCP基因序列(PQ212952.1)与分离自大口黑鲈蛙病毒的MCP基因序列(ON418985.1)和分离自孔雀鱼蛙病毒的MCP基因序列(FR677325.1)聚为一支，与分离自黑尾海猪鱼蛙病毒的MCP基因序列(ON595973.1)聚为一大类；与分离自美洲牛蛙蛙病毒的MCP基因序列(AB474588.1)和青蛙蛙病毒的MCP基因序列(MH016573.1)形成不同分支；与分离自牙鲆的传染性脾肾坏死病毒MCP基因序列(AY633991.1)形成不同的两类。

Figure 3. Phylogenetic tree of amplification product sequence of raravirus in diseased mandarin fish

图3. 患病鳜蛙虹彩病毒扩增产物序列的系统发育树

4. 讨论

本研究中患病鳜的主要症状为体表溃烂，肝脏无血色，呈苍黄色，死亡速度快。镜下未观察到寄生虫，且肝、脾、肾等重要组织器官细菌分离鉴定结果也未显示出优势致病菌，排除了寄生虫病和细菌病的可能。另外通过鳜几种常见病毒性疫病的检测发现，除了鳜鱼蛙病毒以外，其他病原均未检出，且测序结果与感染其他鱼类的蛙病毒属同源性达到100%。初步推测，此次天津滨海新区养殖场鳜鱼发病的致病原可能是由蛙病毒属类病毒性病原所致，但仍需其他实验进一步证实。

20世纪60年代，蛙病毒首次从豹蛙(Rana pipiens)分离得到[12]，能够感染鱼类、两栖类和爬行类，有着“冷血动物杀手”之称，能够引发很高的发病率和死亡率，严重危害着水生动物的安全。目前，蛙病毒成员已经从至少175种爬行和两栖动物中分离出来，近几年该种病原对水产鱼类的危害也在日趋严重。范玉蕾等从体表出血，体色变浅，死亡率较高的似鲇高原鳅(Triplophysa siluroides)体内分离得到一株蛙病毒(FYL140220) [13]，罗晓雯等从1例体表出血，肝脏发白的患病大口黑鲈体内分离出一株蛙病毒[14]，Teng等从患病石斑鱼体内分离鉴定出一株蛙病毒，并进行了全基因组测序分析工作[15]。鳜鱼在养殖过程中的传染性脾肾坏死病毒病因为其危害较大，被业内人士广泛熟知，但是鳜鱼蛙病毒病公开报道的资料还比较少，特别是临床症状和检测方法对养殖者开展养殖过程中疫病的防控工作具有重要意义。

通过本研究流行病学调查得到的患病鳜临床症状特点与其他物种感染蛙病毒后表现出的症状比较发现，均具有体表溃烂、损伤、出血和溃疡的表现[16]，各内脏组织的观察发现，患病鳜的肝脏几乎完全变为白色，严重缺血，但是肾脏通过肉眼观察未出现明显病理变化，这与大鲵[17]和大鳄龟[18]的患病临床表现不一致，但与似鲇高原鳅和大口黑鲈的症状相类似，究其出现这种差异的原因可能是物种亲缘关系远近有关，还可能是由于病毒致病力差异造成的，这仍需要进一步的病理切片等相关实验进行深入研究。本研究中采用大口黑鲈源蛙虹彩病毒衣壳蛋白部分序列扩增引物对患病鳜组织核酸进行的PCR检测，扩增结果经测序显示与大口黑鲈分离株(LMBV-FS2021)主要衣壳蛋白基因序列相似性100%，遗传进化分析结果也说明该患病鳜感染的蛙病毒与分离自大口黑鲈的蛙病毒亲缘性最近，又由于大口黑鲈和鳜鱼本身同属于鲈形目，分类地位相近，对虹彩病毒科的病原均易感，因此对于此次患病鳜病毒来源推测有可能来源于大口黑鲈。

鳜鱼体表溃烂问题一直是养殖者十分困惑的疾病，死亡率很高，原因不明确。多数养殖者遇到这种情况通常会当作细菌病进行处理，大量使用一些抗生素和消毒剂，往往适得其反，更加速了鳜鱼的死亡率和患病率。通过此次患病鳜流调结果也提示我们， 鳜鱼也可能感染蛙病毒，其临床症状初期表现与细菌病比较相似，所以仍需要进行病毒类疫病的PCR检测才能够对所患疾病进行初步判断，合理用药。该病原在本市发现还比较少，但对本市大口黑鲈及鳜鱼的养殖已经造成威胁，应引起广大养殖者及研究者的高度关注。

5. 结论

本文采用流行病学调查、寄生虫观察、细菌分离以及PCR方法对天津市滨海新区某鳜鱼养殖场的患病鳜进行了病原学鉴定与分析，通过扩增序列的比对和进化树分析初步认为此次患病鳜的致病原为蛙虹彩病毒属的一种，该序列与大口黑鲈源蛙病毒相似度最高，达到100%，推测该病原可能来自于大口黑鲈。提示该病原对本市大口黑鲈及鳜鱼的养殖已经造成威胁，应引起广大养殖者及研究者的高度关注。

基金项目

天津市农业发展服务中心种业青年科技创新项目(zxkj202421)。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。

参考文献