1. 引言
烟草(Nicotiana tabacum L.)属茄科烟草属的一年生草本植物，是重要的经济作物之一。烟草行业已成为全球一个非常大的产业，其税收已成为我国政府财政收入的重要来源[1] [2]。在我国积极发展环保型和资源节约型农业战略的背景下，减少农药和化肥的使用是最重要的。因此，微生物菌剂有着广泛的应用前景。有益微生物菌落不仅能够提高土壤或基质的养分供应能力，还可以通过将生殖内定给作物的根系表面或内部从而间接或直接地影响作物的生长[3]。相关研究表明，施用微生物菌剂可促进番茄种子萌发和植株生长[4]，优化烟草苗期农艺性状[5]，对枸杞生长发育、增产与改善品质方面均有正面影响[6]。
研究发现，植物苗阶段根际土壤中细菌群落的结构和功能决定了植物未来的健康[7]。因此，育苗基质拌微生物菌剂可以提前构建植物苗期根际微生物组，从而达到促进植物生长的目的。育苗基质拌菌是一种含有生物微生物的基质，其微生物活性是一种促进植物生长和幼苗转移后生长促进功能的技术[8]。
微生物菌剂中枯草芽孢杆菌[9]可以活化土壤，提高肥效，可以降低成本，并提高农作物的抗病性[10]。哈茨木霉菌可以在植物的根周围生长形成保护膜，防止有害细菌侵入到根中，减少有害细菌的传播[11]。淡紫紫孢菌可以显著抑制线虫的感染，并促进种子萌发和植物营养器官生长[12]。为此，本研究采用浸润法进行烟苗育苗，在育苗基质中分别拌入三种不同的微生物菌剂来研究不同微生物菌剂对烟草苗生长的影响效果。研究结果为进一步在烟草生产上的推广应用提供了依据，具有一定的理论和实践意义。
2. 材料与方法
2.1. 试验材料
供试品种：烟草催芽包衣种子(云烟99)，由云溪中烟种子有限责任公司提供。
供试菌：哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、淡紫紫孢菌(Paecilomyces lilacinus)，均由山东益泰生物工程有限公司提供。
供试药剂：无菌水、育苗基质、石英砂、碳酸钙、丙酮、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、甲硫氨酸、四氮唑蓝、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、核黄素、愈创木酚、过氧化氢、硫代巴比妥酸、氢氧化钠、三氯乙酸、考马斯亮蓝、标准蛋白质、乙醇、磷酸、茚三酮、磺基水杨酸、冰醋酸、脯氨酸、甲苯。
2.2. 试验方法
2.2.1. 试验设计
本试验采取浸润法进行育苗，每个育苗盘使用约625 g基质，分别在基质中拌入3种不同的微生物，经处理后进行常规育苗操作。
微生物菌剂制成菌悬浮液，哈茨木霉菌(有效活菌数10亿/g)和淡紫紫孢菌(有效活菌数10亿/g)各称取1 g溶于100 mL水。枯草芽孢杆菌(有效活菌数200亿/g)称取0.05 g溶于100 mL水。将菌悬浮液通过均匀喷雾的方式加入625 g基质中(相当于每株烟草苗约用12.5 g基质，含有效活菌数2 × 107 cfu)。
本试验共设4个处理，分别在基质中添加3种不同微生物菌剂和清水对照(CK)处理。基质和菌液混配均匀后，室温自然发酵24小时，基质转移至育苗盘。采用50孔育苗穴盘进行育苗，每个处理设置3个重复。在环境适宜的育苗大棚内(洛南县烟草育苗合作社)进行培养，每天观察烟草苗发芽生长情况，发芽后再经培育一个月左右，随机选取培育的烟草苗进行指标测定。
2.2.2. 测定方法
1) 株高、根长和鲜重：每个处理随机选取10株烟草苗，分别用软尺测量烟草苗的株高和根长，测量鲜重并记录平均值。
2) 干重：每个处理随机选取10株烟草苗，将洗干净的烟草苗放入烘箱中，在90℃下处理30 min，再调节70℃烘干至恒重。测量干重并记录平均值。
3) 称取各处理烟草苗鲜叶，采用分光光度法测定叶绿素(a、b、总)含量(mg/L)、SOD活性(吸光度/g∙FW)、POD活性(ΔA470/min∙gFW)、CAT活性(Δ240/min∙gFW)、MDA含量(μmol/gfw)、可溶性蛋白含量(mg/Gfw)和游离脯氨酸含量(μg/g鲜重)。具体测定方法参考文献[13]。
2.3. 数据分析
使用Excel 2016对数据进行整理，然后进行数据处理和分析。
3. 结果与分析
3.1. 三种不同微生物菌剂对烟草苗农艺性状的影响
由表1可知，育苗基质拌菌处理的烟草苗的株高、根长、鲜重和干重均优于对照组。
Table 1. Effect of three different microbial agents on the agronomic characters of tobacco seedlings
表1. 三种不同微生物菌剂对烟草苗农艺性状的影响
处理 |
株高/cm |
较CK增加/% |
根长/cm |
较CK增加/% |
鲜重/g |
较CK增加/% |
干重/g |
较CK增加/% |
CK (清水) |
4.00 |
|
4.00 |
|
0.550 |
|
0.028 |
|
哈茨木霉菌(Th) |
4.80 |
20 |
4.80 |
20 |
0.652 |
18.4 |
0.035 |
36.8 |
枯草芽孢杆菌(Bs) |
5.10 |
27.5 |
5.30 |
32.5 |
0.819 |
48.9 |
0.042 |
53.2 |
淡紫紫孢菌(Pl) |
4.90 |
22.5 |
5.00 |
25 |
0.655 |
18.9 |
0.037 |
29.7 |
3.2. 三种不同微生物菌剂对烟草苗生理指标的影响
3.2.1. 三种不同微生物菌剂对烟草苗叶绿素含量的影响
从表2和图1可以看出，育苗基质中拌入微生物菌剂之后，烟草苗叶片中叶绿素的含量均有提高。育苗基质经枯草芽孢杆菌处理，烟草苗叶片中叶绿素的含量与对照组相比显著增加，叶绿素a含量最高，为对照组的7.789倍；拌淡紫紫孢菌处理过的烟草苗叶片叶绿素b含量最高，为2.136倍；苗基质拌枯草芽孢杆菌处理过的烟草苗叶片总叶绿素含量最高，为4.439倍。
Table 2. Effects of three microbial inoculants on chlorophyll content of tobacco seedlings
表2. 三种不同微生物菌剂对烟草苗叶绿素含量的影响
处理 |
叶绿素a含量/mg/L |
叶绿素b含量/mg/L |
总叶绿素含量/mg/L |
CK (清水) |
0.213 |
0.361 |
0.547 |
哈茨木霉菌(Th) |
0.467 |
0.573 |
1.040 |
枯草芽孢杆菌(Bs) |
1.659 |
0.769 |
2.428 |
淡紫紫孢菌(Pl) |
1.416 |
0.771 |
2.187 |
Figure 1. Effects of three microbial inoculants on chlorophyll content of tobacco seedlings
图1. 三种不同微生物菌剂对烟草苗叶绿素含量的影响
3.2.2. 三种不同微生物菌剂对烟草苗SOD、POD、MDA、CAT活性的影响
由表3可知，育苗基质拌不同微生物菌后，烟草苗SOD活性均降低，POD、MDA、CAT活性有增、有减。其中育苗基质拌枯草芽孢杆菌处理的烟草苗SOD活性与对照组相比显著降低，降低了88.03%；拌哈茨木霉菌处理的烟草苗POD活性与对照组相比显著降低，降低了58.34%；拌枯草芽孢杆菌处理的烟草苗CAT活性与对照组相比降低了18.04%；拌淡紫紫孢菌处理的烟草苗MDA含量与对照组相比显著降低，降低了95.04%。
Table 3. Effects of three microbial agents on SOD, POD, MDA and CAT of tobacco seedlings
表3. 三种不同微生物菌剂对烟草苗SOD、POD、MDA、CAT的影响
处理 |
SOD活性 |
POD活性 |
MDA含量 |
CAT活性 |
CK(清水) |
289.760 |
3.624 |
0.726 |
15.908 |
哈茨木霉菌(Th) |
238.740 |
1.510 |
1.654 |
14.350 |
枯草芽孢杆菌(Bs) |
34.689 |
3.322 |
0.814 |
13.038 |
淡紫紫孢菌(Pl) |
140.797 |
5.134 |
0.036 |
216.152 |
3.2.3. 三种不同微生物菌剂对烟草苗可溶性蛋白含量、游离脯氨酸含量的影响
由表4可知，育苗基质经枯草芽孢杆菌处理的烟草苗可溶性蛋白含量与对照组相比增加显著；拌哈茨木霉菌处理的烟草苗可溶性蛋白含量与对照组相比有所降低。而拌哈茨木霉菌处理的烟草苗游离脯氨酸含量与对照组相比显著增加，增加了3.04倍；育苗基质拌枯草芽孢杆菌处理的烟草苗游离脯氨酸含量与对照组相比降低了18.11%。
Table 4. Effects of three microbial inoculants on the content of soluble protein and free proline in tobacco seedlings
表4. 三种不同微生物菌剂对烟草苗可溶性蛋白含量、游离脯氨酸含量的影响
处理 |
可溶性蛋白含量(mg/Gfw) |
游离脯氨酸含量(μg/g) |
CK(清水) |
3.715 |
206.800 |
哈茨木霉菌(Th) |
3.141 |
628.880 |
枯草芽孢杆菌(Bs) |
6.886 |
169.340 |
淡紫紫孢菌(Pl) |
4.590 |
96.140 |
4. 讨论
烟草农艺性状和生理活性对于烟草产量及抗逆性有重要影响。烟草农艺性状是指烟草具有的与生产有关的特征特性，如株高、根长、鲜重和干重等。叶绿素是植物光合作用的主要色素，是反映植物叶片生理活性变化的重要指标之一。MDA是植物细胞膜脱脂或过氧化的最终产物，较高的MDA值表明对植物细胞膜的损伤更大[14]。MDA含量是质膜氧化的产物之一，间接反映了植物的抗性生理学[15]。本试验中拌淡紫紫孢菌处理的烟草苗MDA含量降低了，说明添加淡紫紫孢菌能有效提高烟草苗中抗氧化剂酶的活性，提高膜结构的稳定性。相关研究表明，植物细胞可以通过积累可溶性蛋白质和渗透物(例如游离脯氨酸)来调节细胞渗透压，增加适应环境的压力[16]。许多研究表明，脯氨酸诱导合成与植物抗逆境能力的增加有正相关。通过测定植物中游离脯氨酸的含量，可以判断逆境对植物的危害程度和植物对逆境的抵抗能力[17]。不同微生物菌剂对烟苗促生效果的不同可能与微生物菌与寄主的特异性有关[18]。本试验结果也与这一结论相同。
综上，育苗基质拌枯草芽孢杆菌、淡紫紫孢菌和哈茨木霉菌所育的烟草苗在株高、根长、鲜重、干重等农艺性状上都有促生效果，烟草苗叶片中叶绿素的含量均有提高，且育苗基质拌枯草芽孢杆菌烟草苗生长最好，效果最佳。
育苗基质拌菌技术在烟草和番茄的种植生产中已有广泛的应用，且相关研究均表明拌菌处理可以增加土壤细菌和放线菌数量，降低真菌数量，优化土壤微生物区系，增强植株长势，降低病害的发生，提高叶片叶绿素含量，进而达到增产提质的目的[19]-[21]。上述研究主要应用的是枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和荧光假单胞菌等微生物，或者复合微生物。本研究首次将有益的细菌(枯草芽孢杆菌)和真菌(淡紫紫孢菌和哈茨木霉菌)分别设置单因素对照研究，并结合生长生理指标进行对比分析，显示出枯草芽孢杆菌在烟草育苗促进生长方面的显著优势。
5. 结论
本研究以商洛地区主栽的云烟99品种为研究对象，通过设置基质拌菌单因素对照试验，测定烟苗株高等农艺性状和过氧化物酶(POD)等生理指标，探索在应用不同微生物菌剂对烟苗生长的影响差异。(1) 育苗基质经枯草芽孢杆菌、淡紫紫孢菌和哈茨木霉菌处理后，烟苗在农艺性状和叶绿素含量上均表现出正向促进，其中枯草芽孢杆菌对烟草苗生长的影响显著优于对照组，效果最佳。(2) 三种微生物菌剂对烟苗超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、质膜氧化程度(MDA)含量、渗透调节物质(可溶性蛋白含量和游离脯氨酸含量)生理指标的影响效果存在差异，这可能与三种微生物促进烟草生长的路径与机制不同导致。(3) 本研究首次将有益的细菌(枯草芽孢杆菌)和真菌(淡紫紫孢菌和哈茨木霉菌)分别设置单因素对照研究进行对比分析，显示出枯草芽孢杆菌在烟草育苗促进生长方面的显著优势。淡紫紫孢菌和哈茨木霉菌育苗基质处理在生产实践上主要分别用于烟草根黑腐、茎腐病和根结线虫病的防控，本研究表明其对烟草也有一定的促生作用。本研究结果为烟草育苗基质拌菌技术提供了参考。
NOTES
*通讯作者。