1. 引言
氮素污染是引起水体富营养化的原因之一。生物脱氮被公认为是经济有效的污水脱氮方法之一。硝化作用是污水生物脱氮处理过程中的一个重要环节。传统的硝化作用是由自养型微生物完成的。然而，自养硝化细菌存在着生长缓慢，对高浓度有机物耐受性较差等问题。随着研究的深入，人们发现异养硝化现象广泛地存在于不同的环境中。异养硝化 [1] 作用一般是指异养微生物在好氧条件下将氨/铵或化合价为−3的有机氮化合物转化为羟胺，进而转化为亚硝酸盐和硝酸盐的过程 [2] 。与传统自养硝化微生物相比，异养硝化微生物具有生长快速、适应能力强等特点。异养硝化微生物在高氨氮和高C/N废水处理中有较大的应用前景。
目前对于异养硝化的研究多集中于菌株的分离鉴定、性能测试 [3] [4] [5] 以及异养硝化菌株在反应器中的应用 [6] [7] [8] ，而对于异养硝化过程中关键酶的研究相对较少。异养硝化过程中的关键酶有氨氮加氧酶(AMO)、羟胺氧化酶(HAO) [9] [10] [11] 等。AMO是异养硝化过程中第一个关键酶，起着将
转化为NH2OH的作用，常被用作硝化过程的功能标记基因 [12] 。由于AMO为膜结合型酶 [13] [14] ，其分离纯化难度较大。因此，目前关于AMO酶纯化及三维结晶的报道很少。
本实验室在前期研究中分离纯化出的一株具有异养硝化功能的细菌Alcaligenes faecalis (粪产碱杆菌) NR [15] 。在本研究中，采用PCR技术以及生物信息学方法，对粪产碱杆菌NR的AMO的基础理化性质以及三级结构进行分析，以期为深入了解异养硝化过程中的关键酶提供参考。
2. 材料与方法
2.1. 菌株培养
本研究所使用菌株为实验室分离的粪产碱杆菌NR，NCBI数据库登录号为FJ151629。将储存于4℃条件下的粪产碱杆菌NR接种于灭菌后LB培养基中，于30℃、120 rpm条件下隔夜培养后用于提取基因组DNA。
LB培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L。
2.2. PCR扩增
取1 mL隔夜培养的粪产碱杆菌NR菌悬液，使用Omega细菌基因组DNA提取试剂盒，按照操作说明提取细菌基因组DNA，作为PCR扩增所用模板。采用DNAMAN 7软件根据NCBI数据库中检索到的Alcaligenes faecalis ZD02氨单加氧酶基因序列（GenBank登录号为NZ-CP013119）设计引物A1 (表1)，根据Alcaligenes faecalis ZD02氨单加氧酶基因序列向3’和5’端分别延伸500 bp后所得序列设计引物A2 (表1)。PCR反应采用25μL体系，体系包含以下溶液、试剂：2 × Premix Ex Taq 12.5 μL，正、反向引物各1 μL (10 μmol/L)，DNA模板1 μl (40 ng/μL)，RNase-free water 9.5 μL。PCR扩增条件如下：94℃预变性5 min，接着进行30循环：94℃变性30 S，退火30 S (引物A1退火温度52℃，A2退火温度55℃)，72℃延伸1 min，最后72℃下补充延伸7 min。PCR产物采用1.5%琼脂糖电泳进行分析检测，对符合预期的条带运用Omega胶回收试剂盒回收，并AT克隆测序。
2.3. AMO基因序列分析
对测序得到的基因序列先采用NCBI在线比对工具BLASTN进行比对分析，确认该段序列是否为AMO基因序列。确定为目标基因序列后，使用NCBI在线开放阅读框(ORF)预测工具ORF finder预测该段序列可能编码的AMO氨基酸序列。所得AMO氨基酸序列运用在线软件ProtParam和ProtScale对其等电点、分子量以及亲疏水性进行分析 [16] 。采用在线跨膜分析软件TMHMM-2.0 [17] 对AMO跨膜区进行分析预测。
2.4. AMO高级结构分析
使用在线蛋白质三维结构预测工具Phyre 2 [18] 对AMO的三维结构进行分析预测，并采用3DligandSite [19] 服务器对模型可能存在的结合位点进行预测，运用PDBsum Generation对所得模型进行评估。最后使用Chimera 1.11对模型进行可视化操作。
3. 结果与讨论
3.1. PCR结果
采用Primer BLAST工具以数据库中粪产碱杆菌基因组DNA为模板，对引物A1和A2进行进一步的验证，结果显示两对引物均只有一种特异性产物，且长短与预期相当，这说明引物A1和A2对粪产碱杆菌都具有较好的特异性，可以用于后续PCR扩增实验。然而PCR结果显示(图1)，引物A1的产物具有多条条带，且目标条带亮度很低；而A2引物虽然产物条带单一，特异性也好，但是其长度约为1700 bp比预期长500 bp (表1)。然而A2产物单一且特异性良好，可以排除引物错配的可能。经测序该段PCR产物长度为1639 bp。
3.2. 序列分析
经BLAST比对，本研究所得到基因序列为amoA基因。ORF finder预测结果显示(图2)，该段基因序列有一长度为1041 bp的阅读框(304-1344 bp)。这个阅读框编码总共编码346个氨基酸，该阅读框包含初始密码和终止密码，并且阅读框5’和3’还余有约300 bp碱基。因此，认为该阅读框所编码的是一条完整的肽链。此外，ExPASy工具预测的蛋白质的理论等电点为9.38，属于碱性蛋白。其分子量大小为36.7 kDa，
Table 1. Primers for amo gene PCR amplification
表1. 氨单加氧酶基因引物序列
注：F为正向引物，R为反向引物。
Figure 1. PCR product agarose electrophoresis figure of amo gene
图1. 氨单加氧酶基因PCR产物琼脂糖电泳图
Figure 2. ORF analysis results of amoA
图2. 氨单加氧酶基因ORF分析结果
比自养硝化菌AmoA大6-8 kDa [20] ，与从异养硝化菌Paracoccus denitrificans胞内分离纯化得到AmoA分子量大小相近(38 kDa) [13] 。
运用ExPASy网站的在线分析工具ProtScale对Amo序列的亲疏水性进行分析，结果显示该段氨基酸序列的最大亲水性指数(hydropath)为2.658，最小亲水性为−0.8，总平均亲水性(GRAVY, Grand average of hydropathicity)为0.972，总平均亲水性的数值越大说明该蛋白疏水性越强。此外，预测结果图显示，AmoA蛋白大部分区域是疏水的(图3)。因此，该蛋白是疏水性蛋白。
在线跨膜预测软件TMHMM-2.0预测显示(图4(a))，AmoA蛋白的氨基酸非跨膜螺旋指数为195.86 ( > 18，当大于18时该蛋白分有可能是跨膜蛋白，或者有信号肽)，首端60个氨基酸的跨膜指数为34.98 ( > 10，当大于10时N端存在信号肽)。因此可断定，AmoA的N端可能存在信号肽，且该蛋白为跨膜蛋白，这与Moir [13] 等和Klotz等 [20] 得研究结果一致。如图4(b)所示该蛋白总共存在12个跨膜螺旋区，且该蛋白的N−端和C−端均位于膜外细胞周质一侧。
Figure 3. Curve: system result of standard experiment
图3. 标准试验系统结果曲线
Figure 4. Transmembrane analysis results of AmoA amino acid sequence. (a) Results of TMHMM, the red shades were transmembrane ranges; (b) Results of Phyre 2, black was cell membrane, yellow was transmembrane structure
图4. 氨单加氧酶氨基酸序列跨膜预测结果。(a) TMHMM跨膜预测结果，红色阴影为跨膜区；(b) Phyre 2跨膜预测结果，黑色表示细胞膜，黄色表示跨膜结构
Figure 5. Tertiary structure prediction results of AmoA, (a) ribbon of AMO; (b) hydrophobic surface of AMO, red means hydrophobic, blue means hydrophilic
图5. 氨单加氧酶三级结构预测结果，(a) AMO 三级结构骨架；(b) AMO三级结构亲疏水表面，红色表示疏水，蓝色表示亲水
Figure 6. Ramachandran plot of Amo tertiary structure model
图6. 氨单加氧酶三级结构模型拉氏图
3.3. AMO三级结构
由于PDB数据库中未找到现有的AMO模型，也未找到同源性> 30%的模型。因此，使用Phyre 2采用串线法对AMO的三维结构进行预测。模型以c4n7wA为模板构建，目标序列与模板序列的覆盖率为85%，最终得出的模型的置信度为98.6%。使用Chimera 1.11软件对预测结果进行可视化操作，所得结果如图5所示。如图5(a)所示，AMO绝大部分区域为α螺旋结构，一般而言α螺旋区域也是跨膜区域 [21] 。如图5(b)所示，该蛋白表面大部分为疏水区域(红色为疏水区域，蓝色为亲水区域)，特别是中间部分，这与前面跨膜结构预测及亲疏水性分析相吻合。此外，3DLigandSite预测结果显示AMO具有一个镍原子结合位点，然而有报道认为AMO含有的是Cu原子结合位点 [14] 。
拉氏图常用于指明蛋白质或多肽高级结构中允许和不允许的构象，一共分为最佳区域(红色)、次允许区(褐色)、最大允许区域(黄色)和不允许区域(浅黄色)四个区域。当位于最佳区域的氨基酸残基所占比例大于90%，且位于不允许区域的氨基酸比例不超过1%时所得模型的稳定性较好 [21] 。图6为AMO模型所对应拉氏图。如图6所示，所得模型中位于红色区域的残基所占比例为94.9%，余下5.1%位于褐色区域，没有残基位于黄色和浅黄色区域，这说明预测所得AMO模型构象良好。
4. 结论
采用PCR技术成功扩增粪产碱杆菌NR基因组DNA中AMO基因序列，得到长度为1639 bp的DNA序列。经BLAST比对所得基因序列为amoA序列，包含编码AMO活性位点序列。该段序列包含1个完整的开放阅读框(ORF)，编码长度为346 aa的多肽链。经比对分析该序列为AMO蛋白质序列。该蛋白序列分子量大小为36.7 kDa，是碱性蛋白(pI = 9.38)也是疏水性蛋白(GRAVY = 0.972)。此外，AMO也是跨膜蛋白，有12个跨膜区，C端和N端均位于膜外细胞周质一侧。成功构建AMO三级结构模型，模型置信度为98.6%，含有一个金属镍原子结合位点。拉氏图表明，AMO模型位于最佳区域的氨基酸残基所占比例为94.9 %，该模型构象良好。
基金项目
中央高校基本科研业务费(106112016CDJXY210007)。