1. 引言
按ICTV分类，禽白血病(Avian leukosis)是由反转录病毒科正反转录病毒亚科α反转录病毒属禽白血病病毒(Avian leukosisvirus, ALV)引起的一类禽肿瘤性疾病，同时引起免疫抑制和产蛋下降。临床上常见的有淋巴细胞性白血病、成红细胞性白血病、骨髓细胞性白血病和成红细胞性白血病 [1] 。感染鸡的白血病的亚型有A、B、C、D、E、J和K [2] 七个亚型，其中仅E亚型是内源性禽白血病，其余均为外源性病毒。由J亚型引起的骨髓细胞性白血病是致病性和传染性最强的外源性病毒，对养禽业危害最大 [3] 。禽白血病可进行水平传播和垂直传播。目前在大部分的西方国家ALV已被彻底净化，而在中国依旧普遍存在。近年来国家要求从源头上对祖代以上种禽场进行禽白血病的净化，我市祖代种禽场从2009年开始禽白血病的净化工作，经过七年的净化工作，初步取得成效。
2. 材料
2.1. 材料
ALV P27抗原ELISA检测试剂盒、ALV-J亚型和ALV-A/B亚型抗体ELISA检测试剂盒，购自IDEXX公司，核酸抽提试剂盒和PCR反应试剂购自TAKARA公司。A、B、J亚型的ALV病毒核酸阳性样本由中国动物疫病预防控制中心赠送，PCR引物(参考高玉龙文章) [4] 由上海英捷潍基公司合成。
2.2. 样品
采集留种母鸡开产初期第一枚或第二枚鸡蛋的蛋清，或在22周龄或30周龄血清；种公鸡孵化出壳后24小时的泄殖腔棉拭子或30周龄公鸡血清，共采集母鸡样本57,450份，公鸡样本11,867份。
3. 方法
泄殖腔棉拭子、蛋清和血清中的禽白血病抗原使用IDEXX公司的P27抗原ELISA试剂盒进行检测，随机抽取部分检测结果阳性样品用PCR来进行分型鉴定。血清抗体使用IDEXX公司的ALV-J亚型和ALV-A/B亚型抗体ELISA检测试剂盒进行检测 [5] ，利用excel表格对检测数据进行统计分析。
4. 结果
4.1. P27抗原检测结果
4.1.1. 公鸡和母鸡的检测结果
从表1看，公鸡的P27抗原阳性率大于母鸡的P27抗原阳性率，且波动幅度比较大。禽白血病普遍存在于玉林市的鸡群中，尤其是在净化初期，P27抗原总体阳性率高达9.68%。经过七年的连续净化，阳性率从最初的9.68%降低到1.56%，但在2014年出现阳性回升的现象。
4.1.2. 不同样本的检测结果
对2010~2016年部分种禽场不同样本类型的禽白血病样本的P27抗原进行ELISA检测(见表2)，泄殖腔棉拭子的P27抗原阳性率 > 蛋清的P27抗原阳性率 > 血清的P27抗原阳性率。
4.2. 同批次血清样品抗体检测情况
2015~2016年通过对同批次血清样品中的A/B抗体和J抗体ELISA检测，结果(见表3)得知玉林市的广西三黄鸡中不仅存在J亚型ALV，也存在A/B亚型。A/B抗体总阳性率为11.24%，J抗体总阳性率为7.78%，同批次血清的A/B抗体阳性率连续两年均大于J抗体阳性率。
4.3. 抗原分型结果
对25份P27抗原检测呈阳性的蛋清样本抽提核酸进行A、B和J亚型的分子生物学诊断进行PCR，结果A亚型：0% (0/25)；B亚型：32% (8/25)；J亚型：4% (1/25)。
Table 1. Avian leucosis P27 antigen ELISA testing results of the cock and hens in Yulin breeding company from 2009-2016
表1. 2009~2016年玉林市种禽场公鸡和母鸡禽白血病P27抗原ELISA检测结果
Table 2. Avian leucosis P27 antigen ELISA testing results of the different samples in some breeding companies from 2010-2016
表2. 2010~2016年部分种禽场不同样本类型的禽白血病P27抗原ELISA检测结果
Table 3. ELISA testing results of A/B and J antibodies of ALV
表3. ALV的A/B抗体和J抗体的ELISA检测结果
5. 分析和讨论
5.1. 检测方法的选择
本文采用商品化的ELISA试剂盒进行检测。在持续监测中，发现在2014年P27抗原阳性呈短暂上升趋势，经调查，主要表现为公鸡的P27抗原阳性率增加，了解到2014年采用公鸡血清进行监测，因其试剂盒本身的限制，血清样本检测抗原效果已经经过验证，但受内源性禽白血病的影响干扰大，并不是进行外源性检测的最佳样本，故会在初期检测时出现抗原阳性明显增加的现象。
5.2. 公母鸡中ALV的监测
2009~2014年，公鸡中的ALV阳性率整体大于母鸡，说明自然条件下公鸡中ALV阳性率比较高。在畜牧生产中，公母鸡比例约1: 50，因此在净化中，特别要加强对种公鸡的净化淘汰工作，随后通过对种公鸡的血清和棉拭子进行交互检测淘汰，取得了良好的效果。
5.3. 分型
P27抗原是ALV的特异性抗原，同样存在于内源性E亚型禽白血病中 [6] 。内源性的禽白血病虽然不会引起具备致病性，但干扰外源性禽白血病的净化，故需对初步筛查P27呈阳性的样品进行分型诊断。由于病毒分离在临床中应用存在一定难度，故对同批次的种鸡血清进行ALV的A/B和J亚型抗体检测，发现A/B抗体阳性率连续两年均大于J抗体阳性率，说明对玉林市的广西三黄鸡中不仅存在J亚型ALV，也存在A/B亚型，且A/B亚型阳性率高于J亚型。通过对25份禽白血病P27抗原阳性样品进行A、B、J亚型的PCR分型诊断，证实玉林地区三黄鸡群中的主要存在的禽白血病亚型是B亚型，因此除了对传统J亚型的净化外，还应特别关注B亚型的ALV的净化工作。
5.4. 样本类型的选择
由于不同样本类型对结果的影响比较大，在进行净化时应考虑样本因素。王明月 [7] 等证实，P27抗原检测ELISA值(S/P)大于1.5 (蛋清)或2.0 (泄殖腔)的鸡只，分离外源性ALV的比例为100%，检测值不小于1.0 (蛋清)或1.5 (泄殖腔棉拭子)的鸡只，病毒分离比例在90%以上；检测值为0.2以上的鸡只，病毒分离比例仅为59% (蛋清)和32.4% (泄殖腔棉拭子)，说明肛拭子在检测时由于样本内含物复杂，S/P值普遍比蛋清检测值大，故各场在净化时应根据实际情况，进行检测样本的选择，或者不同样本结合起来进行净化。
6. 玉林市禽白血病净化技术关键点
经过七年的净化工作，玉林市祖代种禽场禽白血病净化取得了显著效果，2015、2016年连续两年有两家企业获得了农业部“禽白血病净化创建场”称号，根据实际净化情况，建议应在以下三个关键点做好净化控制。
6.1. 垂直筛选净化
张胜斌 [8] 等人对广西三黄鸡祖代或父母代种鸡的泄殖腔棉拭子和血清进行监测，发现商品三黄鸡群中普遍存在ALV感染，公母鸡在开产前后和产蛋高峰期有两个检测高峰，同时结合我市净化实际情况，建议如下：留种母鸡开产初期采集第一枚或第二枚鸡胚的蛋清进行P27抗原检测，将检测出阳性的母鸡及其子代全部淘汰，阴性留作种用；种母鸡在产蛋高峰30周龄采集血清进行P27抗原检测，阴性留作种用，阳性淘汰；种公鸡在孵化出壳后一日龄内采集泄殖腔棉拭子，并在22周和30周采集血清进行P27抗原检测效果更佳。
6.2. 水平控制
种蛋入孵时消毒，同一个母鸡产生的阴性后代集中起来放入同一个孵化器内进行孵化。小群饲养，检测出阳性应及时淘汰，并对栏舍进行定期消毒。运送鸡苗的笼具和车辆进出场均要进行消毒，养殖场内的笼具不与外界的笼具交替使用。
6.3. 严格把控疫苗质量
所有弱毒疫苗使用前进行禽白血病抗原的检测，只有禽白血病检测阴性的疫苗方可用于免疫。
基金项目
本项目由玉林市科学研究与技术开发计划项目《禽白血病的控制与净化技术研究与应用》(玉市科攻1421029)支持。
NOTES
*通讯作者。