阿尔茨海默病血液的生物标志物研究与展望

Research and Prospect of Blood Biomarkers for Alzheimer’s Disease

摘要: 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种不可逆的神经退行性疾病，影响多种高级认知皮质功能，包括记忆、思维能力、定向力、理解、学习能力、语言和判断能力等。近年来AD的诊断和治疗仍存在许多挑战，对于临床前AD或轻度认知障碍(mild cognition impairment, MCI)的AD患者，药物治疗的效果并不显著，目前也没有很好的解决方案。AD最具特征性的生物体液标志物是脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)，由于血液比脑脊液更容易获得，因此在临床诊断或筛查以及临床试验中重复取样时，血液取样比脑脊液取样更可取，AD的生物标志物的开发正在从CSF转移到血液中。血液中AD核心发病机制的要素，包括Aβ42沉积、tau蛋白、血浆(plasma)蛋白或脂质(lipids)已显示出它们在AD诊断中的作用和能力，用于AD诊断和预测的血液标记物也得到了广泛的研究。研究证明，MCI和AD患者的血浆Aβ42/40比值显著降低；血浆p-tau231与血浆p-tau181，在AD的失智阶段具有较高的诊断准确性，能将Aβ阳性的AD和MCI病例与Aβ阴性的AD病例较准确地区分。因此，为了在健康人群中筛查AD的风险，血液生物标记物在AD早期诊断和治疗的新靶点，也许是今后AD研究的方向。

Abstract: Alzheimer’s disease (AD) is an irreversible neurodegenerative disease that affects a variety of high-level cognitive cortical functions, including memory, thinking ability, orientation, understanding, learning ability, language and judgment. In recent years, there are still many challenges in the diagnosis and treatment of AD. For AD patients with preclinical AD or mild cognition impairment (MCI), the effect of drug therapy is not significant, and there is no good solution at present. The most characteristic biofluid marker for AD is cerebrospinal fluid (CSF). Since blood is more readily available than CSF, blood sampling is preferable to CSF sampling for clinical diagnosis or screening and for repeated sampling in clinical trials. Development of biomarkers for AD is moving from CSF to blood. The core pathogenesis of AD in the blood, including Aβ42 deposition, tau protein, plasma proteins or lipids, has shown their role and ability in the diagnosis of AD. Blood markers for the diagnosis and prediction of AD have also been extensively studied. The ratio of plasma Aβ42/40 in patients with MCI and AD was significantly decreased. Plasma p-tau231 and plasma p-tau181 have high diagnostic accuracy in the dementia stage of Alzheimer’s disease, and can distinguish Aβ-positive AD and MCI cases from Aβ-negative AD cases with high accuracy. Therefore, in order to screen the risk of AD in healthy people, blood biomarkers in the early diagnosis and treatment of AD may be the direction of future AD research.

1. 引言

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一种致命的神经退行性疾病，是晚年最常见的失智症，估计占病例的60%至80% [1]。大多数AD病例是散发的，只有少于5%的一小部分是可遗传的 [2]。大多数散发性AD患者年龄超过65岁，在此时间点之后，AD发展的风险每五年翻一番，到85岁时达到30%以上 [3]。目前，AD的诊断依赖于失智的临床症状，磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)确定脑体积，正电子发射断层成像(Positron Emission Tomography, PET)检测大脑淀粉样蛋白或tau沉积。AD最具特征性的生物体液标志物是脑脊液(cerebrospinal fluid, CSF)中β淀粉样蛋白-42 (Aβ42)水平降低，磷酸化tau (p-tau)和总tau (t-tau)水平升高。然而，侵入性较小且易于检测的诊断AD的生物标志物，特别是在早期阶段，仍在开发中。CSF生物标志物反映了AD的三个特征，即Aβ沉积、神经原纤维缠结和神经变性。基于对无症状的AD患者开始治疗的需要，以及在大量年轻、健康的个体中筛查AD风险的需要 [4]，AD的生物标志物的开发正在从CSF转移到血液中。血液中AD核心发病机制的要素，包括Aβ42、tau蛋白、血浆(plasma)蛋白或脂质(lipids)已显示出它们在AD诊断中的作用和能力。

自从第一例关于AD的病例报告以来，斑块和缠结是AD的神经病理学特征，已知由“淀粉样蛋白”组成 [5]，1985年的一篇论文发表了从AD脑组织斑块中纯化的40个氨基酸(4 kDa)蛋白质的完整序列，淀粉样蛋白斑由40个氨基酸肽组成(就是现在的淀粉样蛋白β或Aβ)。斑块中普遍存在Aβ同种型由42个氨基酸残基组成，称为Aβ42。该肽是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)的短片段，被称为β-和γ-分泌酶的特定蛋白酶切割掉。APP是具有单个跨膜结构的跨膜蛋白，在人体中以几种多肽为代表——APP695、APP751和APP770 [6]。APP蛋白中42~43个氨基酸的Aβ结构域被预测部分嵌入质膜 [7]，APP异构体的多样性源于APP基因的可变剪接和随后的翻译后修饰 [8]。APP751和APP770存在于所有组织中，而APP695是最丰富的神经元形式。因此，APP被两种假定的酶切割，被称为β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶(早老素复合物)的酶，是产生Aβ所必需的 [9]。β-分泌酶(β-位点APP切割酶1-BACE1)是一种可切割APP胞质结构域的单体蛋白。γ-分泌酶是四种蛋白质(早老素、nicastrin、早老素增强子2-PEN2和前咽缺陷1-APH1)的多聚体复合物，其切割位点嵌入膜中 [10]。γ-分泌酶可以在多个位点切割APP并产生各种Aβ同工型：Aβ38、Aβ39、Aβ40和Aβ42。与γ-分泌酶不同，APP可以在Aβ序列中间被α-分泌酶切割，从而从淀粉样蛋白生成途径中退出。

对于包括AD在内的脑部疾病，液体生物标记物的开发是以脑脊液为基质开始的，与血液相比，脑脊液具有接近脑实质的优势，脑蛋白从脑细胞外空间分泌到脑脊液，脑脊液可以进入脑脊液腰椎穿刺收集 [8]。由于血液比脑脊液更容易获得，因此在临床诊断或筛查以及临床试验中重复取样时，血液取样比脑脊液取样更可取。此外，血液是比脑脊液更具挑战性的脑生物标志物基质，原因有几个。首先，必须在含有非常高浓度的血浆蛋白(如白蛋白和IgG)的基质中测量进入血液的微量脑蛋白，这给分析方法带来很高的干扰风险 [11]。其次，除了稀释，释放到血液中的脑蛋白可能会被蛋白酶降解，在肝脏代谢或被肾脏清除，这将引入一种与大脑变化无关的变异，并且难以控制。这也限制了寻找AD血液生物标志物的可能性 [12]。然而，超灵敏免疫分析和质谱领域的技术发展带来了新的希望 [13]。

2. 血浆中的Aβ

至今，CSF的Aβ浓度、Aβ42和Aβ40是早期诊断症状性AD的应用最广泛的血液标志物。与Aβ42浓度相比，Aβ42/Aβ40浓度比与患者的PET阳性状态有更好的对应关系。因此，CSF中Aβ42与Aβ40的浓度比被推荐为改善临床前AD诊断的价值 [14]。在识别AD患者时，Aβ42与Aβ40的浓度比(Aβ42/40比)被认为优于单独的Aβ42浓度，主要是其AD诊断的准确性，重要的是能够区分AD和其他类型的失智(非AD) [14]。

尽管大量关于脑脊液Aβ42的论文一致发现与斑块负荷的淀粉样PET测量结果高度一致 [15]，并且AD显著减少，但关于血浆Aβ42作为反映脑淀粉样病变(以及AD)的生物标记物的研究令人失望，结果相互矛盾，患者和对照组之间Aβ42和Aβ40水平无变化或轻微变化，且存在较大重叠 [16]。这种与疾病病理学的缺乏联系可能是由于外周组织对血浆抗体的贡献，血浆和脑脊液抗体浓度之间缺乏相关性也证明了这一点 [17]。疾病相关性差也可能与使用ELISA方法或其他标准免疫分析的分析缺陷有关，例如疏水性Aβ肽结合血浆蛋白掩盖表位 [18]，或通过分析改进可能减轻的其他干扰。

2011年，一种基于单分子阵列(Simoa)技术的测量血浆中Aβ42的新方法 [19]。这项技术基于在磁珠上的蛋白质生物标记物的免疫捕获，磁珠被捕获在femtolitre容积孔中，然后添加酶标记的检测抗体和数字量化，允许精确量化Aβ42至每毫升亚像素水平。高分析灵敏度允许对样品进行预分解，从而减少基体干扰。在大型瑞典BioFINDER研究队列中评估该分析时，发现血浆Aβ42和Aβ42/40比值与相应的脑脊液测量值以及皮质[¹⁸F]氟美他莫PET滞留之间存在微弱但显著的相关性 [20]。与对照组相比，MCI和AD患者的血浆Aβ42/40比值显著降低。

AD患者血浆中Aβ42和Aβ40水平的研究结果并不一致，有时甚至是相互矛盾的。Mayeux等 [21] 在随访研究中发现，基线时的AD患者和3年内发展为AD的患者血浆Aβ42水平升高，但血浆Aβ40水平没有升高。与血浆Aβ42水平低的个体相比，血浆Aβ42水平高的个体AD发病的风险增加了2倍以上。之后，一项前瞻性病例队列研究发现，Aβ40的高血浆浓度，尤其是与低浓度的Aβ42相结合时，表明患失智症的风险增加，该研究认为血浆Aβ40浓度高与失智症风险增加相关 [22]，而Yaffe等研究发现血浆Aβ42/Aβ40比值较低与9年以上非失智症老年人的认知功能下降程度较大相关 [23]。这种差异可能来自于检查的临床阶段或其他类型失智症的混合。

使用海马体积测量的MRI和淀粉样PET技术，AD患者和罹患AD的MCI患者可以与其他类型的失智症患者和MCI患者区分开来，这些患者在过去十年中没有发展为AD。Zou等提示AD患者血清中Aβ42/Aβ43比值较低，Aβ43浓度较高，可作为诊断AD的血液标志物 [24]。

Nakamura等人研究还显示，与认知正常的人相比，脑淀粉样阳性AD或轻度认知障碍患者的血浆Aβ42水平显著降低。他们还发现，降低的Aβ42/Aβ669~711和Aβ42/Aβ40比率的组合在预测个体水平的大脑淀粉样蛋白负荷方面表现出最高和最稳定的性能 [25]。最近，其他独立研究一致证实了较低的血浆Aβ42/Aβ40比值与淀粉样蛋白负荷之间的相关性。Perez-Grijalba等人。结果显示，仅血浆Aβ42/Aβ40比值降低就能准确预测阳性，并能发现AD的早期 [26]。

与AD患者脑脊液Aβ42水平降低的研究结果一致，最近的研究强烈表明，AD患者或淀粉样蛋白阳性的MCI患者血浆Aβ42水平也降低。因此，联合使用Aβ42/Aβ40、Aβ42/Aβ43、Aβ42/Aβ669~711、Aβ42/t-tau或Aβ42/p-tau181可以准确地诊断或预测AD。但Gao等随访2年未发现血浆Aβ42、Aβ42/Aβ40与认知能力下降之间存在相关性。该研究认为血浆Aβ40与认知能力下降之间关系非线性的 [27]。Li等认为血浆Aβ40水平较低的人群在2年内认知功能下降较低 [28]。

3. 血液中的p-tau

由于检测脑脊液tau的侵袭性和高昂的费用，血浆tau也成为诊断AD的候选血液标志物，许多研究都集中在AD、MCI和正常人群中tau的定量。AD相关的神经原纤维缠结由过度磷酸化的tau蛋白组成 [29]，使其成为AD生物标志物的有用候选者。通常，tau是一种位于神经元轴突中的微管相关蛋白。由于可变剪接，在细胞中发现了六种不同的tau异构体，长度从352到441个氨基酸残基不等，分子量从50到65 kDa不等。建议过度磷酸化破坏tau结合和稳定神经元中微管的能力，导致微管分解、轴浆流缺陷和神经元连接丧失。

脑脊液p-tau蛋白对AD的高特异性已被证实 [16] [30] [31] [32]。这一结论现在在血液中的结果越来越多 [33] [34] [35] [36]，使血浆p-tau测量成为AD特异性血液生物标志物的主要候选者。尽管p-tau231被广泛报道为脑脊液的生物标志物 [37] - [46]，但迄今为止，尚未见血浆中p-tau231的报道。血浆p-tau231与血浆p-tau181一样，在阿尔茨海默病的失智阶段具有较高的诊断准确性，包括神经病理证实的AD和非AD神经退行性疾病。血浆p-tau231也能将Aβ阳性的CU和MCI病例与Aβ阴性的CU病例区分为较高的准确率，并与Aβ和tau PET密切相关 [47]。

由于血浆中的tau水平远低于脑脊液中的tau水平，Zetterberg等人开发了一种超灵敏的检测方法。他们发现，与对照组或MCI患者相比，AD患者血浆中t-tau水平升高，而发生AD的MCI患者和稳定的MCI患者之间没有发现差异 [13]。Mattsson等人研究了两个大的队列，报告血浆t-tau可能部分反映了AD的病理，但是在AD患者和年龄匹配的对照组之间发现重叠，这表明在个体中使用血浆t-tau作为AD生物标志物是困难的 [34]。Karikari等人进一步证实了发展为AD的AD患者和MCI患者血浆p-tau181水平升高，并表明血浆p-tau181不仅可以将AD失智与正常的年轻人和老年人区分开来，还可以区分FTD、VAD、进行性核上性瘫痪、皮质基综合征、帕金森病和多系统萎缩 [34]。

4. 血液中的其他生物标记物

一项关于ADNI队列的研究显示，AD患者血浆神经纤维丝轻链(Neurofilament light chain, NFL)显著增加(对照水平的149%)，受试者操作特征(ROC)曲线下面积(AUC)值为0.87，与核心AD-CSF生物标记物相当 [48]。虽然MCI组的变化不太明显，但在淀粉样PET扫描阳性的MCI病例中，血浆NFL是最高的，并预测认知恶化更快，未来大脑萎缩(通过MRI测量)和FDG-PET测量的低代谢率更高 [48]。在一项对48名家族性AD (FAD)突变携带者和非携带者的研究中，有症状的FAD患者的血NFL水平增加，但症状前突变携带者的血NFL水平也增加，其水平与预计的症状发病年份以及疾病阶段的认知和MRI测量值相关 [49]。这些结果表明，血液NFL也可以在AD的临床前阶段检测到神经退行性变。

一个重要的知识是，高血浆(或CSF) NFL并不是AD特有的特征。相反，在许多神经退行性疾病中，如额颞叶失智、进行性核上麻痹和皮质基底动脉综合征 [50] [51] 的水平升高。因此，血浆NFL未来的一个可能应用是作为对认知障碍患者的第一次临床评估的筛查测试，例如在初级保健病房。在这里，血浆NFL可以作为简单、无创、廉价的筛查工具，主要用于排除神经退行性变。

因为神经元或突触生物标记物表明在许多神经退行性疾病中普遍存在神经元损伤，所以这些蛋白的血液水平可能不是AD的特异性标记物。Benussi等人评价血清NF-L和p-tau181的诊断和预后价值。他们发现血清NF-L水平在FTD和AD中都升高，并且不能区分AD和FTD，而血清p-tau181水平在AD患者中特别升高 [52]。因此，这些神经元和突触生物标志物目前被认为是神经退行性变的代表，可能是评估AD和其他类型失智进展或程度的参数，但对AD的准确诊断没有帮助。除了与AD核心发病机制和神经退变相关的分子外，还对AD患者的其他血浆蛋白、脂质和代谢产物进行了广泛的研究。

Ray等人采用酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定血浆中18个信号蛋白。这些蛋白质模式的变化可以将进展为AD的AD和MCI与对照组区分开来，准确率接近90%。使用多重分析，Doecke等人发现了另一组血浆蛋白，它们以高度的敏感性和特异性将阿尔茨海默病患者与健康对照区分开来 [53] [54]。这些血浆蛋白的变化似乎是AD中神经变性或其他全身性疾病的结果。由于这些血浆蛋白的数量很多，而且检查所有这些蛋白的费用都很高，所以这些蛋白在AD中的变化模式仍然没有得到其他独立研究的证实。应用定量、靶向代谢组学和质谱技术，对AD患者血液脂质代谢的全身性异常进行了研究。Mapstone等人从健康的老年人中识别出10种磷脂，这些磷脂预测在2~3年内转化为MCI或AD，准确率超过90%，这表明它们用于检测临床前AD的早期神经变性 [54]。

血液中这些磷脂和鞘脂水平的变化可能反映了中枢神经系统脂代谢紊乱和/或神经元变性，在很早期就没有认知症状。然而，它们是否将AD与其他类型的失智症和神经退行性疾病区分开来，还需要进一步的研究。考虑到量化一组血浆蛋白或脂质的成本很高，单一的血液标志物可能更容易用于在大量人群中筛查阿尔茨海默病。

5. 血液生物标记物的优劣

CSF对AD的生物标志物的研究已有多年的历史，已发现了许多对AD的诊断、预后或预测未来预后的强有力的标志物。然而，由于获取CSF是侵入性的，可能会导致预后症状，因此在大量无症状人群中使用CSF样本进行体检以筛查AD的风险是不切实际的。虽然收集CSF以测量Aβ种类是AD诊断的金标准，但存在风险。因此，建立具有高AD敏感性和特异性的低风险血液Aβ测试是值得期待的。研究表明血浆Aβ42水平在诊断和AD病理学纵向研究中的潜在用途。传统的ELISA用于测量血浆中的Aβ42水平不够灵敏，无法定量低水平。尽管已经开发出诸如单分子阵列或免疫沉淀质谱等超灵敏测定来定量血浆Aβ42水平，但仪器和试剂的高成本限制了它们的使用 [55]，Mehta等开发一种灵敏且具有成本效益的化学发光(chemiluminescence, CL)免疫测定法来检测人血浆中的低Aβ42水平 [55]。

CSF和血液分析的比较

血液检测指标，如血胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，已被广泛用于预测健康和无症状人群患动脉硬化和心脑血管疾病的风险。然而，一种用于AD诊断或预测AD风险的安全、侵入性较小、容易获得的血液标志物仍未进入临床使用阶段。在每年的体检中，从中年到老年，对大量健康的人群进行常规的血液样本采集。例如，最近来自不同小组的研究表明，血Aβ42降低和血p-tau181升高可能分别反映了AD早期脑淀粉样蛋白沉积和神经原纤维缠结。AD患者血样中某些血浆蛋白、血脂、Aβ43和Flotillin的变化还需要不同组别的证实。然而，在不久的将来，使用血液生物标志物来明确AD的诊断或预后将是可行的。

血液在可及性、采样技术、潜在诊断工具对常规无创检测的适用性以及反复采样的纵向临床评估等方面优于脑脊液 [30]。然而，在血液中检测AD生物标志物与多种并发症相关。由于CSF离脑实质最近，从脑细胞外间隙分泌的蛋白质可通过腰椎穿刺直接到达。相反，脑蛋白必须通过血脑屏障(blood-brain barrier, BBB)才能进入血液。BBB起着选择性过滤器的作用，因此只有一小部分脑蛋白质进入血液。这些脑蛋白可能在通过BBB之前或之后被切割、修饰或降解。最后，血浆含有多种背景蛋白，其中一些含量很高，而在这种复杂的混合物中只能检测到相对少量的脑蛋白。这就是为什么当血液样本采用CSF检测方法时，需要对样品制备和测量程序进行额外的验证和调整。例如，与CSF相比，血浆中的Aβ浓度约低50倍 [56]，而血浆中的背景蛋白水平约高100倍 [57]。1999年至2014年期间通过ELISA测定进行的22项研究的广义结果未能检测出AD患者和对照组之间Aβ水平的任何显著差异 [16]。这表明，无论是修改现有的分析方法，以提高其敏感性，还是发展新的分析技术，都是识别血液中AD生物标志物的必要条件。

6. 结论

血液样本的数量和规模将比CSF样本在开发AD血液生物标志物方面具有更大的优势。在过去的15年中，已经进行了许多用于AD诊断、预后和预测的血液标志物的研究，一些生物标志物已经成为AD侵袭性较小的血液标志物的候选者。除了CSF生物标记物外，用于AD诊断和预测的血液标记物也得到了广泛的研究。尽管一些关于AD患者血液中Aβ42水平的报道相互矛盾，但最近的研究表明，淀粉样蛋白阳性的AD患者和MCI患者的血液Aβ42水平降低。此外，AD和MCI患者血浆中少量但可检测到的p-tau和t-tau增加。然而，在AD患者和年龄匹配的对照组之间，血浆Aβ42、t-tau和p-tau水平存在相当大的重叠。进一步鉴定其他潜在分子，并利用这些分子与Aβ42或tau蛋白的比值，可以显著提高筛查和鉴别前驱或临床前AD与正常人群的准确性和敏感度。某些血浆蛋白和血脂在AD诊断中也可能有潜力，但需要更特异的生物标志物，检查费用也需要降低。由于仍然没有有效的药物来阻止AD的进展，因此需要在临床前阶段开始预防性治疗和疾病修正治疗。寻找AD早期诊断和治疗的新靶点仍是今后AD研究的方向。为了在健康人群中筛查AD的风险，AD生物标志物的开发已经转向使用侵入性较小的血液或非侵入性唾液或尿液样本。鉴于血液生物标记物的广泛研究和令人信服的证据，很可能成为AD诊断和筛查的下一代生物标记物。

基金项目

本文获宁德师范学院引进人才项目基金(2019Y20)、2021年福建省社科基金西部扶持项目(FJ2021X023)及2022年宁德师范学院引进人才项目基金(2022Y24)支持。

NOTES

^*第一作者。

^#通讯作者。