蛋白结合尿毒症毒素对尿毒症患者血管内皮细胞的损伤作用及机制研究

Study on the Damage Effect and Mechanism of Protein Binding Uremic Toxin on Vascular Endothelial Cells in Uremic Patients

摘要: 目的：研究蛋白结合尿毒症毒素对尿毒症患者血管内皮细胞的损伤作用及机制。方法：选取我院透析室维持性血液透析的尿毒症患者42例和健康管理科健康志愿者31例，每例各抽取静脉全血10 ml，经过血清分离、透析、低温真空冻干等处理后提取血清蛋白，4℃保存备用。加入不同浓度的蛋白溶液尿毒症血清蛋白溶液为尿毒症组、正常血清蛋白溶液为正常组，完全培养基为对照组。采用CCK-8法对HUVEC细胞增殖能力进行检测；采用流式细胞仪分析HUVEC细胞凋亡能力；于倒置相差显微镜下观察3组培养72 h后的HUVEC细胞形态。使用NO试剂盒检测NO表达水平；采用rt-PCR检测IL-8 mRNA、ET-1 mRNA表达量。结果：同一时间点，3组相比，尿毒症组增殖率明显降低(P < 0.05)；同一时间点，随着浓度的增加，尿毒症组细胞受抑制的程度明显增加(P < 0.05)；同一浓度的血清蛋白溶液，随时间的增加，尿毒症组细胞增殖率明显下降(P < 0.05)。相较于对照组与正常组，尿毒症组不同时间点HUVEC细胞凋亡显著升高，但无差异(P > 0.05)。相较于对照组与正常组，尿毒症组NO分泌显著降低(P < 0.05)，随着浓度的增加NO分泌量显著减少(P < 0.05)。相较于对照组与正常组，尿毒症组IL-8 mRNA表达量显著升高(P < 0.05)，随着浓度的增加IL-8 mRNA表达量显著增加(P < 0.05)。相较于对照组与正常组，尿毒症组ET-1 mRNA表达量显著升高(P < 0.05)，随着浓度的增加ET-1 mRNA表达量显著增加(P < 0.05)。相较于对照组与正常组，尿毒症组eNOS mRNA表达量显著降低(P < 0.05)，随着浓度的增加eNOS mRNA表达量显著降低(P < 0.05)。尿毒症组EMPs表达较高(P < 0.05)。结论：蛋白结合尿毒症毒素能够抑制细胞增殖及NO的分泌，提高IL-8 mRNA、ET-1 mRNA的表达量，促进细胞损伤，提示其是心脑血管并发症的重要诱发因素之一。

Abstract: Objective: To study the damage effect and mechanism of protein binding uremic toxin on vascular endothelial cells in uremic patients. Methods: 42 uremic patients with maintenance hemodialysis in the dialysis room of our hospital and 31 healthy volunteers in the health management department were selected. 10 ml of venous whole blood was extracted from each patient. After serum separa-tion, dialysis, low-temperature vacuum freeze-drying and other treatments, serum protein was ex-tracted and stored at 4˚C for standby. Different concentrations of protein solution were added. Ure-mic serum protein solution was the uremic group, normal serum protein solution was the normal group, and complete culture medium was the control group. The proliferation of HUVEC cells was detected by CCK-8 method; The apoptotic ability of HUVEC cells was analyzed by flow cytometry; The morphology of HUVEC cells cultured for 72 h in three groups was observed under inverted phase contrast microscope. NO expression level was detected using NO kit; rt-PCR was used to detect the expression of IL-8 mRNA and ET-1 mRNA. Results: At the same time point, the proliferation rate of uremia group was significantly lower than that of the three groups (P < 0.05); At the same time point, with the increase of concentration, the degree of cell inhibition in uremia group increased significantly (P < 0.05); In the same concentration of serum protein solution, the cell proliferation rate of uremia group decreased significantly with the increase of time (P < 0.05). Compared with the control group and the normal group, the apoptosis of HUVEC cells in uremia group was significantly increased at different time points, but there was no difference (P > 0.05). Compared with the control group and the normal group, the NO secretion in the uremic group decreased significantly (P < 0.05), and the NO secretion decreased significantly with the increase of the concentration (P < 0.05). Compared with the control group and the normal group, the expression of IL-8 mRNA in the uremic group was significantly increased (P < 0.05), and the expression of IL-8 mRNA was significantly in-creased with the increase of the concentration (P < 0.05). Compared with the control group and the normal group, the expression of ET-1 mRNA in uremic group was significantly increased (P < 0.05), and the expression of ET-1 mRNA was significantly increased with the increase of concentration (P < 0.05). Compared with the control group and the normal group, the expression of eNOS mRNA in the uremic group decreased significantly (P < 0.05), and the expression of eNOS mRNA decreased sig-nificantly with the increase of concentration (P < 0.05). The expression of EMPs was higher in ure-mia group (P < 0.05). Conclusion: Protein binding uremic toxin can inhibit cell proliferation and NO secretion, increase the expression of IL-8 mRNA and ET-1 mRNA, and promote cell damage, sug-gesting that it is one of the important inducing factors of cardiovascular and cerebrovascular com-plications.

1. 引言

慢性肾脏病(Chronic kidney disease, CKD)对人们的日常生活及生命安全带来严重的影响，且随着年龄增加而增加。相关研究表明，CKD所致主要并发症是心血管疾病(CVD)，且发病风险不仅在终末期肾病明显增加，在患者肾功能不全的情况下也随之增加 [1] [2] [3]。由于临床中对于该现象无法做出明确诊断，因此部分学者提出尿毒症危险因素对此类疾病发生具有一定的作用。蛋白结合尿毒素正属于结合类血清白蛋白。据统计，迄今共发现20多种毒素，大部分分子量较小，而处于结合状态后，其分子量增加，这就造成了透析清除困难。据研究显示，当尿毒症毒素与血清蛋白结合后，蛋白结构变化，容易与药物竞争结合位点，同时还会形成对滴，进而对机体造成损害 [4]。尿毒症毒素会随着肾功能的减退而逐渐累及，随着其水平的不断升高，进而导致代谢紊乱、尿毒症症状及多个系统功能障碍等 [5] [6]。心脑血管疾病作为尿毒症患者中最常出现的并发症之一，近年来关于尿毒症素为尿毒症发生的特有因素成为了新的研究方向，因此本文对蛋白结合尿毒症毒素对尿毒症患者血管内皮细胞的损伤作用进行研讨，并深入分析影响血管内皮细胞的损伤作用的作用机制。

2. 材料与方法

2.1. 材料

研究细胞：人脐静脉内皮细胞株(Human umbilical vein endothelial cell line, HUVEC) (上海谷研实业有限公司)，DMEM高糖培养基、胎牛血清、0.25%胰酶(上海语纯生物科技有限公司)，CD144抗体(深圳市豪地华拓生物科技有限公司)，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(弗元(上海)生物科技有限公司)，CCK-8试剂盒(北京康瑞纳生物科技有限公司)，NO、IL-8、ET-1试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)。

提取血清蛋白及配置

选取我院透析室维持性血液透析的尿毒症患者42例和健康管理科健康志愿者31例，抽取10 mL，分离、透析等一系列处理后进行提取蛋白，备用。

2.2. 细胞培养及分组

培养HUVEC，条件：10%胎牛血清DMEM高糖，37℃下孵育，传代。生长至对数后，进行接种，在6孔板以2 × 10⁴个/cm²分组，贴壁融合后，换培养基，洗涤2次加入不同浓度的蛋白溶液尿毒症血清蛋白溶液(0.4%, 1.0%, 2.0%, 4.0%)为尿毒症组、正常血清蛋白溶液(0.4%, 1.0%, 2.0%, 4.0%)为正常组，刺激内皮细胞，设置完全培养基(对照组)。

2.3. 指标观察

2.3.1. HUVEC细胞增殖检测

选取尿毒症组(0.4%, 1.0%, 2.0%, 4.0%)、正常组(0.4%, 1.0%, 2.0%, 4.0%)和空白对照组HUVEC进行实验，设置3个复孔；分别培养24、48、72 h。孵育到相应时间点，弃上清，PBS洗涤2次，配制检测反应液(CCK8:完全培养基 = 1:9)，100 μL/孔，避光孵育4 h，酶标仪于450 nm波长处检测各孔光密度值[D(450)]，以无细胞组作为调零组。

2.3.2. HUVEC细胞凋亡检测

选取4%尿毒症组、4%正常组和空白对照组HUVEC进行实验。72 h后，收集细胞，洗涤3次，按照AnnexinV/PI试剂盒操作，使用流式细胞仪进行检测。

2.3.3. HUVEC细胞形态

在显微镜下观察细胞形态。

2.3.4. NO表达水平

取浓度为4%的尿毒症组正常组和对照组HUVEC进行实验，设置3复孔，培养25、48、72 h，到相应时间点后，取各组上清，放置于1.5 mL管中；然后PBS洗涤2次，按NO试剂盒说明书依次加入检测试剂，最后置于酶标仪中在540 nm处测其光密度值[D(540)]。

2.3.5. IL-8 mRNA、ET-1 mRNA、eNOS mRNA表达量

选取浓度为0.4%、1.0%、2.0%、4.0%尿毒症组、正常组和对照组HUVEC进行实验。TRIzol法提取RNA，合成cDNA，rt-PCR检测内皮细胞白介素8 (interleukin-8, IL-8)、ET-1的mRNA表达、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)。Real-Time PCR引物序列见表1，由bioT-NT公司合成。

Table 1. PCR primer series

表1. PCR引物序列

2.3.6. 内皮细胞膜微粒(EMPs)检测

选取4%尿毒症组、4%正常组和空白对照组HUVEC进行实验。72 h后，取上清，4℃离心5 min；再取上清，4℃离心1 h；弃上清，加入1 mLPBS膜微粒；取其中100 μL，加入10 μL CD144抗体，气浴恒温振荡器100 r/min，孵育30 min；加入300 μL PBS，使用流式细胞仪进行检测。

2.4. 统计学方法

临床研究过程中详细记录患者的各项研究的数据资料，将其录入到计算机当中，关于患者的结果相关数据使用SPSS21.0统计学软件处理，计数单位和计量单位分别使用(%)和( $\bar{x}\pm s$ )表示对数据比较结果采用x²、t进行检验，最终得出P < 0.05，具有统计学意义。

3. 结果

3.1. 不同浓度蛋白对HUVEC细胞增殖的影响

在同一时间点，各组相比，尿毒症组增殖率明显降低(P < 0.05)；同一时间点，随着浓度的增加，尿毒症组细胞受抑制的程度明显增加(P < 0.05)；同一浓度，随着时间的增加尿毒症组增殖率明显降低(P < 0.05)，如表2所示。

3.2. 不同时间点4.0%浓度蛋白对HUVEC细胞凋亡的影响

相较于对照组与正常组，尿毒症组不同时间点HUVEC细胞凋亡显著升高，但无差异(P > 0.05)。见表3、图1。

A：对照组；B：4.0%正常组；C：4.0%尿毒症组

Figure 1. Comparison of 72-hour apoptosis of HUVEC cells between two groups

图1. 两组HUVEC细胞72 h凋亡情况比较

Table 2. Effects of different concentrations of protein on proliferation of HUVEC cells ( $\bar{x}\pm s$ )

表2. 不同浓度蛋白对HUVEC细胞增殖的影响( $\bar{x}\pm s$ )

注：a表示同一时间点对照组与正常组对比，P < 0.05；b表示同一浓度、不同时间点尿毒症组对比，P < 0.05；c表示同一时间点、不同浓度尿毒症组比，P < 0.05。

Table 3. Effects of 4.0% concentration of protein on apoptosis of HUVEC cells at different time points ( $\bar{x}\pm s$ )

表3. 不同时间点4.0%浓度蛋白对HUVEC细胞凋亡的影响( $\bar{x}\pm s$ )

3.3. 3组血清蛋白对HUVEC细胞形态的影响

对照组HUVEC细胞呈鹅卵石样排列有序，大小、边界清。4.0%正常组的HUVEC细胞生长状态欠佳，大小稍统一，表面欠光整，细胞突起。4.0%尿毒症组的HUVEC细胞状态差，形态各异，大小不统一，细胞间隙明显增宽，表面粗糙，突起多，部分呈网状，胞浆颗粒增多，如图2所示。

A：对照组；B：4.0%正常组；C：4.0%尿毒症组

Figure 2. Cell morphology after 72 h culture in 3 groups (×100)

图2. 3组培养72 h后细胞形态(×100)

3.4. 3组培养72 h后HUVEC细胞NO分泌情况

相较于对照组与正常组，尿毒症组NO分泌显著降低(P < 0.05)，随着浓度的增加NO分泌量显著减少(P < 0.05)，如表4及下图3所示。

Table 4. Comparison of NO secretion of HUVEC cells in 3 groups after 72 h culture [( $\bar{x}\pm s$ ), μmol/L]

表4. 3组培养72 h后HUVEC细胞NO分泌情况对比[( $\bar{x}\pm s$ ), μmol/L]

注：a与对照组相比P < 0.05；b与正常组相比P < 0.05。

Figure 3. NO secretion of HUVEC cells in 3 groups after 72 h culture

图3. 3组培养72 h后HUVEC细胞NO分泌情况

3.5. 3组培养72 h后HUVEC细胞IL-8 mRNA表达量对比

相较于对照组与正常组，尿毒症组IL-8 mRNA表达量显著升高(P < 0.05)，浓度越高，IL-8 mRNA表达量越高(P < 0.05)如表5及下图4所示。

Table 5. Comparison of IL-8 mRNA expression in HUVEC cells after 72 h culture among 3 groups ( $\bar{x}\pm s$ )

表5. 3组培养72 h后HUVEC细胞IL-8 mRNA表达量对比( $\bar{x}\pm s$ )

注：a与对照组相比P < 0.05；b与正常组相比P < 0.05。

Figure 4. IL-8 mRNA expression of HUVEC cells in 3 groups after 72 h culture

图4. 3组培养72 h后HUVEC细胞IL-8 mRNA表达量

3.6. 3组培养72 h后HUVEC细胞ET-1 mRNA表达量对比

相较于对照组与正常组，尿毒症组ET-1 mRNA表达量显著升高(P < 0.05)，浓度越高，ET-1 mRNA表达量越高(P < 0.05)如表6及下图5所示。

Table 6. Comparison of ET-1 mRNA expression in HUVEC cells after 72 h culture among 3 groups ( $\bar{x}\pm s$ )

表6. 3组培养72 h后HUVEC细胞ET-1 mRNA表达量对比( $\bar{x}\pm s$ )

注：a与对照组相比P < 0.05；b与正常组相比P < 0.05。

Figure 5. ET1 mRNA expression of HUVEC cells in 3 groups after 72 h culture

图5. 3组培养72 h后HUVEC细胞ET-1 mRNA表达量

3.7. 3组培养72 h后HUVEC细胞eNOS mRNA表达量对比

相较于对照组与正常组，尿毒症组eNOS mRNA表达量显著降低(P < 0.05)，随着浓度的增加eNOS mRNA表达量显著降低(P < 0.05)如表7所示。

Table 7. Comparison of eNOS mRNA expression levels in HUVEC cells from 3 groups after 72 h culture ( $\bar{x}\pm s$ )

表7. 3组培养72 h后HUVEC细胞eNOS mRNA表达量对比( $\bar{x}\pm s$ )

注：a与对照组相比P < 0.05；b与正常组相比P < 0.05。

3.8. 对EMPs所产生的影响

尿毒症组EMPs表达分别高于正常组、对照组(P < 0.05)，正常组EMPs表达高于正常组(P < 0.05)如表8所示。

Table 8. Comparison of EMPs expression among 3 groups [( $\bar{x}\pm s$ ), %]

表8. 3组EMPs表达对比[( $\bar{x}\pm s$ ), %]

4. 讨论

慢性肾脏病(Chronic kidney disease, CKD)患病率逐年增高，已高达10%，与此同时，肾衰竭的患者也呈递增趋势。随着肾功能的衰退，患者会产生许多并发症。流行学结果分析表明，即使肾功能轻度损伤，其心脑血管疾病的发病率也远高于健康人群 [6] [7] [8]。诸多学者研究发现，尿毒症素已成为引起CDK心血管发生的主要因素。

尿毒症毒素的研究从60年代末就开始，诸多学者进行了相关研究，但由于技术限制，直到本世纪初，才逐渐对尿毒症毒素的分子、蛋白结构等进行研究。CDK死亡率较高，有报道指出 [9]，大部分患者死亡均与心血管并发生有关。国外学者通过对慢性肾脏疾病患者的危险因素进行研究发现，不仅包含高血压、高血脂等传统因素，还有诸如尿毒症毒素、氧化应激等因素 [10]。研究显示，当尿毒症毒素与血清蛋白结合后，蛋白结构变化，容易与药物竞争结合位点，同时还会形成对滴，进而对机体造成损害 [11]。近年来分子分离与检测技术的不断发展，诸多学者发现了蛋白尿毒症的新型毒素。这对后期的预防有着极为重要的作用。对于尿毒症毒素的清除，临床上主要采用血液透析和腹膜透析。与蛋白结合尿毒症毒素相比，小分子水溶性毒素和中分子毒素能取得较好的清除效果 [12] [13] [14] [15]。本文研究显示，同一时间点，随着浓度的增加，尿毒症组细胞受抑制的程度明显增加且同一浓度的血清蛋白溶液，随时间的增加，尿毒症组细胞增殖率明显下降。此结果说明，蛋白溶液能够直接作用于尿毒症组细胞，降低其细胞增殖率。

血管内皮细胞损伤及功能障碍是血管疾病的始动环节 [16] [17]。本文研究中发现，对照组HUVEC细胞大小均一、边界清晰，浓度为4%的尿毒症组细胞生长状态极差，并且大小、形态各不相同，间隙宽，表面粗糙，细胞突起增多。细胞增殖受到抑制，细胞的NO分泌减少、NOS活性则会大大降低；于此同时蛋白浓度的升高，对内皮细胞的损伤则越重，毒性随着浓度的增加而增加。NO是内皮细胞在NOS作用下所分泌的重要舒张因子。NO分泌的减少，会导致血管舒张障碍、增加血管的压力 [18] [19] [20]。内皮细胞损伤后会大量释放浆细胞粘附因子，增加白细胞的生成，促使炎症反应，加速心血管不良事件的发生 [21]。EMPs是一种由脱落得来的微小磷脂囊泡结构，在细胞信息交流、信号启动以及受体转换中发挥着重要作用。循环中的EMPs可调控内皮细胞NO及PGI²信号通路，产生的TXA²可直接作用于平滑肌细胞，且对NO的生成均具有一定的反作用 [22] [23] [24] [25]。本文中，尿毒症组EMPs表达分别高于正常组、对照组，正常组EMPs表达高于正常组，由此说明，蛋白结合尿毒症毒素能损伤内皮细胞，从而增加尿毒症患者心血管事件的发生。

综上所述，蛋白结合尿毒症素能够抑制细胞的增殖、抑制NO的分泌，提高IL-8 mRNA、ET-1 mRNA的表达量，导致HUVEC细胞损伤，提示其属于心脑血管并发症的重要诱发因素之一。

NOTES

^*通讯作者Email: [e-mail]