1. 前言
心血管疾病是导致死亡的首要病因，流行病学调查显示，心血管疾病的发生率逐年升高，低龄化趋势明显。高脂血症是心血管疾病发生的重要危险因素之一，低密度脂蛋白胆固醇是冠状动脉粥样硬化性心脏病的致病性因素。据报告，我国成人高脂血症的患病率高达40.4% [1]，极大地增加了心血管事件风险，为预防心血管疾病的发生，改善脂质代谢具有十分重要的意义。除了经典的降脂药物，饮食结构调整逐渐受到重视[2] [3]。既往研究发现，绿茶中的活性成分，如茶多酚、茶色素等，能够调节体内炎症因子的表达，降低心血管疾病的发生率和死亡率[4]-[6]，茶多酚，还可能参与脂代谢的调控，调节体内血脂水平。为提高茶叶作用的有效性，复合茶叶的制备受到更多的关注。多项研究结果显示，复合茶叶可能具有更明显的调脂作用[7] [8]。恩施玉露茶，是一种产于湖北恩施由鲜嫩芽叶制成的蒸青绿茶。绞股蓝和罗布麻为药食两用，在降压、调脂等方面有一定作用[9]-[11]。然而，目前关于复合恩施玉露茶与脂代谢的研究较少，本研究通过开展动物实验，深入研究饮用复合恩施玉露茶的小鼠血脂水平的变化及相关脂代谢关键酶的水平变化，旨在探究复合恩施玉露茶在调节脂代谢中的作用及可能机制，为茶叶降脂作用研究提供新的思路。
2. 材料与方法
2.1. 实验动物
40只5周龄C57/BL6J小鼠，SPF级，(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)。实验动物质量合格证号为：SCXK (京)2016-0006，开展本实验的单位经许可可以使用该品系小鼠(编号为：SYXK(鄂)2016-0057)，华中科技大学动物实验伦理委员会通过审查。
2.2. 主要实验材料
恩施玉露茶(产地：湖北恩施)、绞股蓝、罗布麻，阿托伐他汀，全自动生化分析仪(Rayto)，PPAR-α抗体(武汉三鹰，15540-1-AP)，LXR-α抗体(武汉三鹰，14351-1-AP)，GAPDH抗体(杭州贤至AB-P-R 001)，抗兔二抗(武汉博士德，BA1054)。IFN-γ (Interferon Gamma) ELISA Kit (伊莱瑞特，E-EL-M0048c)，Mouse IL-6 (Interleukin 6) ELISA Kit (伊莱瑞特，E-EL-M0044c)，Mouse TNF-α (Tumor Necrosis Factor Alpha) ELISA Kit (伊莱瑞特，E-EL-M0049c)。
2.3. 实验方法
复合茶配制：根据成人饮用干茶(10~15) g/d的安全剂量按照实验动物与人的体表面积比值表，计算公式为小鼠剂量 = 9.1 × 成人剂量，经计算得出小鼠每日饮用干茶剂量为(1.3~1.95 g)/(kg·d)，本研究中采用的复合茶剂量为1.5 g/kg/d。将恩施玉露茶、绞股蓝、罗布麻按10:2:0.5比例配制成复合茶。浸泡于95℃左右开水，搅拌均匀，静置6分钟后取上清液，过滤后放入无菌玻璃瓶中。为保证茶叶质量的一致性，每周定时配制溶液，并分装储存于4℃冰箱备用。阿托伐他汀药物作为阳性对照，按照10 mg/kg/d剂量给药，现配现用。
动物分组及给药：将40只C57/BL6J小鼠随机分为4组，分别为健康对照组(A组)、高脂对照组(B组)、复合茶组(C组)、阿托伐他汀组(D组)小鼠高脂饲养8周成为高脂血症模型鼠，给药后改为普通饲养。各组分别给予生理盐水、生理盐水、复合茶、阿托伐他汀，按照0.1 mL·10 g−1体重的给药剂量，每日一次，连续干预4周后取材。
标本收集与检测：所有小鼠禁食水12小时后，通过眼内眦静脉采集血液0.5~1 mL置于肝素管，3000 rpm高速离心后获得血清。采用全自动生化分析仪检测血脂指标。部分血液离心后收集血清，使用ELISA试剂盒进行炎症因子的检测。
实时荧光定量检测(qRT-PCR)：处死小鼠后，留取肝组织，切取部分组织用生理盐水冲洗后固定于4%甲醛溶液中，储存于−80℃冰箱中备用。向组织中加入Trizol试剂后研磨成浆、裂解，经过反复几次裂解后加入氯仿，剧烈颠倒混匀数次后于室温下静置5分钟。经4℃，12,000 rpm，离心15 min，可见组织分为三层。取出上层，加入400 μL异丙醇，混匀后室温静置10 min。再次于4℃，12,000 rpm离心10 min，管底可见白色的RNA沉淀。提取肝组织中的总RNA后，在逆转录反应体系下将RNA逆转录成cDNA。之后再于PCR反应体系中进行PCR扩增。基因定量以GAPDH为内控。GAPDH上游引物为5’-ATGGGTGTGAACCACGAGA-3’，下游引物为5’-CAGGGATGATGTTCTGGGCA-3’，引物长度为229 bp。HL上游引物为5’-CCCACTATGACTTCTACCCC-3’，下游引物为5’-CTCTTGCTCTTGCCTGACC-3’，引物长度为298 bp。根据扩增曲线及熔解曲线计算RNA的表达量。根据qRT-PCR算法计算目的基因的相对表达量。
蛋白印迹分析检测：取部分肝组织，充分裂解以获取总蛋白，通过BCA定量测定组织中的蛋白浓度，并按比例加入蛋白上样缓冲液和蒸馏水，制备变性蛋白样品用于电泳，用PVDF膜转膜。用TBST (封闭液)浸泡PVDF膜，室温封闭2 h，再用一抗孵育液，4℃孵育过夜，洗去一抗，二抗孵育液室温摇床孵育2 h，洗去二抗，使用ECL发光液对蛋白进行可视化处理，用BandScan分析胶片灰度值。
组织病理学观察：提取小鼠肝组织，经脱水、透明、浸蜡、包埋后切片，进行苏木素伊红染色，用光学显微镜观察细胞形态。
2.4. 统计学分析
连续型变量使用均值 ± 标准差表示，使用SPSS 23.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析、方差21。
3. 结果
3.1. 小鼠的体重变化
实验期间各组小鼠状况良好，高脂饲料喂养期间各组小鼠体重增长较快。统计学分析显示，造模完成时与复合茶干预后各组小鼠的体重均无明显差异(P > 0.05) (见图1)。
Figure 1. The change of body weight in mice
图1. 小鼠体重变化
3.2. 检测指标结果
小鼠血脂水平分析结果显示，给予复合茶干预后，与高脂对照组相比，小鼠的TC、TG、LDL水平均有明显降低，HDL水平明显升高。与阿托伐他汀组相比，上述指标无明显差异(见表1)。
Table 1. Blood lipid levels in each group mice
表1. 各组小鼠血脂水平
组别 |
TC/(mmol/L) |
TG/(mmol/L) |
LDL-C/(mmol/L) |
HDL-C/(mmol/L) |
健康对照组 |
1.661 ± 0.549*** |
0.957 ± 0.212*** |
0.733 ± 0.179**** |
2.302 ± 0.479**** |
高脂对照组 |
3.079 ± 0.771 |
1.590 ± 0.391 |
1.346 ± 0.158 |
1.146 ± 0.219 |
复合茶组 |
2.036 ± 0.521** |
1.079 ± 0.328* |
1.082 ± 0.094*** |
2.013 ± 0.336* |
阿托伐他汀组 |
2.109 ± 0.675** |
1.133 ± 0.342* |
0.845 ± 0.149**** |
1.7714 ± 0.379* |
注：与高脂对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
小鼠炎症因子水平分析结果显示，复合茶组小鼠的TNF-α、IL-6、IFN-γ水平显著低于高脂对照组，且与阿托伐他汀组相比，上述指标无明显差异(见表2)。
Table 2. Inflammatory factors in each group mice
表2. 各组小鼠炎症因子水平
组别 |
TNF-α (pg/mL) |
IL-6 (pg/mL) |
IFN-γ (pg/mL) |
健康对照组 |
53.009 ± 19.744*** |
63.577 ± 23.947*** |
36.842 ± 15.589*** |
高脂对照组 |
166.564 ± 53.323 |
204.864 ± 84.13 |
118.286 ± 34.86 |
复合茶组 |
83.137 ± 26.578*** |
103.617 ± 37.81** |
57.532 ± 19.609*** |
阿托伐他汀组 |
93.218 ± 31.935** |
104.618 ± 50.185** |
56.469 ± 20.046*** |
注：与高脂对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
PCR检测结果显示，复合茶组的小鼠HL、HSL基因水平明显高于高脂对照组(见表3)。
Western-blot检测结果分析表明，给予复合茶的小鼠PPAR-α和LXR-α的水平均显著高于高脂对照组，并且与阿托伐他汀组无显著差异(见图2)。
Table 3. HL and HSL gene levels in each group of mice
表3. 小鼠HL和HSL基因表达水平
组别 |
HL |
HSL |
健康对照组 |
1.346 ± 0.429**** |
0.943 ± 0.316* |
高脂对照组 |
0.482 ± 0.22 |
0.442 ± 0.243 |
复合茶组 |
0.963 ± 0.342*** |
0.626 ± 0.239 |
阿托伐他汀组 |
0.991 ± 0.306*** |
0.682 ± 0.277 |
注：与高脂对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
注：与高脂对照组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
Figure 2. LXR-α and PPAR-α expression levels in each group
图2. 各组小鼠LXR和PPAR-α表达水平
小鼠肝脏形态学观察的图片中显示，与健康对照组相比，高脂对照组小鼠肝细胞大量空泡样变性，肝索结构排列紊乱，给予复合茶干预的小鼠上述病理表现明显减少，肝细胞的形态接近正常，空泡样变性少见，肝索结构相对规则(见图3)。
Figure 3. Morphological observation of mice liver (HE staining, ×200)
图3. 鼠肝脏形态学观察(HE染色，×200)
4. 讨论
在本研究中，给予复合恩施玉露茶后，小鼠的血脂水平明显低于高脂对照组，HL基因、PPAR-α和LXR-α蛋白水平显著升高，且与阿托伐他汀组小鼠的血脂水平无显著差异。这表明复合恩施玉露茶可以通过提高肝脂肪酶基因水平，促进PPAR-α和LXR-α表达，从而调节脂质代谢过程，改善血脂水平。
本研究采用的恩施玉露茶采用蒸汽杀青工艺制作而成，能更大程度地保留茶叶的活性成分。绞股蓝归于葫芦科，富含多酚、皂素等，具有降脂、预防动脉粥样硬化和降低心血管事件风险的作用[12] [13]。罗布麻含有大量的黄酮类物质。罗布麻可以诱导肠道菌群改变，改善体重、减少内脏和皮下脂肪的积累[14]。罗布麻还能够减轻血管内皮损伤、改善氧化应激反应，改善高脂血症的预后[12]。
本研究发现，复合恩施玉露茶改善血脂水平，对体重无明显影响，可能与干预时间较短有关，在Yuan [15]的研究中也发现这一点。肝脏是脂质代谢的重要器官，当脂质代谢紊乱时，过多的脂肪会沉积在肝脏组织[16]，复合恩施玉露茶能够显著改善肝脏组织脂肪沉积，在一定程度上保护肝脏功能。肝脂肪酶主要表达于肝细胞和巨噬细胞，参与脂质尤其是HDL的重构和代谢[7] [17]。HL不仅可以水解磷脂和甘油三酯，而且能够增加肝细胞对HDL的摄取，促进胆固醇的逆向转运[18] [19]激素敏感性甘油三酯脂肪酶(HSL)参与脂肪酸β氧化，促进甘油三酯的分解，决定着脂肪动员的进程。本研究中使用复合茶后，HL和HSL基因水平升高，表明复合恩施玉露茶可能通过促进脂肪分解从而降低血脂水平。
肝X受体(LXR)存在于哺乳动物，包括LXR-α和LXR-β两种亚型，过氧化物酶体增殖物激活受体-α (PPAR-α)在肝组织和肝外组织中均有分布，二者都是具有保守DNA结合域和配体结合域的核受体，其中央DNA结合域的锌指结构可以直接介导靶基因中激素反应元素的序列特异性识别，与相应配体结合后通过招募不同的复合物来激活转录，从而直接或间接地调节脂质代谢。目前认为LXR-α主要参与胆汁酸的合成，在胆固醇和极低密度脂蛋白的代谢中起到重要作用。LXR的活化可促进胆固醇的逆向转运，增加肝脏内胆汁酸合成过程中的限速酶的转录，促进胆固醇转变为胆汁酸[20]。PPAR-α通过上调细胞色素P450酶类的表达，增加胆固醇含量后激活LXR，进一步地增强胆汁酸合成[21]。PPAR-α被证明参与多种中药降脂的机制[22]。本研究中饮用复合茶的小鼠PPAR-α和LXR-α含量均有明显增加，表明复合茶降脂的作用机制可能与同时激活PPAR-α和LXR-α有关。
我们的实验也验证了复合茶可以改善炎症反应，治疗后的炎症因子水平与阿托伐他汀作用无显著差异。复合茶降低炎症因子水平的原因可能与多酚表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate, EGCG)有关，EGCG可能通过与细胞表面受体、细胞内信号通路和核转录因子的多重相互作用，抑制丝裂原活化蛋白激酶通路、磷脂酰肌醇-3-激酶通路、Toll样受体4等发挥抗炎、抗氧化、抗纤维化等作用，在心血管疾病、代谢性疾病、肿瘤疾病等中有广泛的应用[23]。结合既往研究，推测复合恩施玉露茶可能通过茶叶中的茶多酚阻断了Toll样受体4的信号通路，调节体内的炎症因子的水平[24]。
本研究仍存在一些局限性，一方面，本研究未进行绞股蓝、罗布麻或者恩施玉露茶的单个成分水剂的对照，未能说明复合茶剂是否比单剂降脂效果更好，在接下来的研究中应当设置复合茶剂与单一茶剂的对比研究，进一步证实复合茶剂的效果。另一方面，本研究未能进行长期的观测，实验周期不够长，未能明确长期饮用复合茶剂是否能够起到长期降低血脂的作用，但初步实验结果表明，复合茶剂能够显著改善血脂水平，在未来的研究中，应当进一步延长观察时间。
综上所述，本研究结果表明，恩施玉露茶、绞股蓝及罗布麻组成的复合茶可以显著降低高脂血症小鼠的血清胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白，并升高高密度脂蛋白水平，其作用机制依赖于肝脂肪酶和激素敏感性脂肪酶基因水平升高，进而上调过氧化物酶体增殖物激活受体α和肝X受体α蛋白表达水平，此外，复合恩施玉露茶可能具有一定的抗炎作用。