β-Catenin、CyclinD1、c-myc、Dvl-1在氟化钠诱导心肌细胞中的表达

Expression of β-Catenin, CyclinD1, c-myc, and Dvl-1 in Cardiomyocytes Following Induction by Sodium Fluoride

摘要: 目的：氟化钠(NaF)染毒人心肌细胞(AC16)，实时荧光定量PCR (qRT-PCR)法检测Wnt/β-catenin信号通路中β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白(CyclinD1)、myc癌基因(c-myc)、蓬乱蛋白1 (Dvl-1) mRNA的表达情况，为氟中毒所致心肌损伤机制提供理论依据。方法：体外培养AC16细胞，设置不同浓度梯度NaF进行染毒，将其分为0 umol/LNaF组(对照组)、680 umol/L NaF组、1360 umol/L NaF组、2720 umol/LNaF组，染毒24 h后置于倒置荧光显微镜下观察其细胞形态，CCK-8法检测细胞存活率；qRT-PCR检测染毒24 h细胞中Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、CyclinD1、c-myc、Dvl-1 mRNA的表达水平。结果：AC16细胞成功造模后CCK-8结果显示，不同浓度NaF染毒AC16细胞24小时，对照组细胞存活率为100% ± 0.08%，染毒组细胞存活率分别为83.66% ± 0.06%、42.75% ± 0.07%、31.75% ± 0.02%。经单因素的方差分析得出(F = 168.97, P < 0.0001)，染毒组细胞存活率均低于对照组(P < 0.0001)；qRT-PCR结果显示，Wnt信号通路中关键性分子mRNA均有不同程度的表达，对照组、680 umol/LNaF组、1360 umol/LNaF组、2720 umol/L。NaF组中β-catenin表达量分别为(1.00 ± 0.73, 1.02 ± 0.23, 5.48 ± 0.72, 2.94 ± 0.10)、c-myc (1.00 ± 0.78, 1.96 ± 0.94, 3.34 ± 0.75, 3.83 ± 0.25)、CyclinD1 (1.00 ± 0.95, 0.98 ± 0.24, 12.36 ± 0.97, 1.05 ± 0.13)以及Dvl-1 (1.00 ± 0.64, 1.51 ± 0.24, 37.54 ± 0.33, 18.96 ± 0.26)。对照组、低、中剂量组随染毒浓度升高，Wnt/β-catenin信号通路β-catenin、CyclinD1、c-myc、Dvl-1 mRNA表达升高，高剂量组反而降低；经单因素方差分析可得，β-catenin (F = 8.16, P = 0.008)；c-myc (F = 4.34, P = 0.043)；CyclinD1 (F = 6.48, P = 0.016)；Dvl-1 (F = 41.90, P < 0.001)；经两组间t检验，与对照组相比，低剂量组差异均无统计学意义(t = 1.741, t = 1.866, t = 1.108, t = 3.708, P > 0.05)，中、高剂量组差异有统计学意义(P < 0.05)；中剂量组与低、高剂量组差异有统计学意义(P < 0.05)。结论：AC16细胞经染氟后成功造模，不同NaF浓度可干扰心肌细胞存活率；低、中剂量的氟可能通过Wnt/β-catenin信号通路导致心肌细胞的损伤，β-catenin、CyclinD1、c-myc、Dvl-1 mRNA表达升高，高剂量氟β-catenin、CyclinD1、c-myc、Dvl-1 mRNA表达反而降低，可能由于Wnt信号通路过度激活反而降低了对心肌细胞的损伤。

Abstract: Objective: Sodium fluoride (NaF) infected human cardiomyocytes (AC16); Real-time quantitative fluorescent PCR (qRT-PCR) was used to detect the expression of β-catenin (β-catenin), CyclinD1, myc oncogene (c-myc) and Dvl-1 mRNA in Wnt/β-Catenin signaling pathway, to provide a theoretical basis for the mechanism of myocardial injury caused by fluorosis. Methods: AC16 cells were cultured in vitro and exposed with different concentration gradients of NaF. They were divided into 0 umol/LNaF group (control group), 680 umol/LNaF group, 1360 umol/LNaF group and 2720 umol/LNaF group. 24 h after exposure, the cell morphology was observed under inverted fluorescence microscope, and the cell survival rate was detected by CCK-8 method. The expression levels of Wnt/β-catenin signaling pathways β-catenin, CyclinD1, c-myc, Dvl-1 mRNA were detected by qRT-PCR in 24 h infected cells. Results: After AC16 cells were successfully modeled, CCK-8 results showed that the survival rate of AC16 cells in the control group was 100% ± 0.08% after 24 hours of exposure to NaF. The survival rates of the infected group were 83.66% ± 0.06%, 42.75% ± 0.07% and 31.75% ± 0.02%, respectively, according to one-way analysis of variance (F = 168.97, P < 0.0001). The survival rates of the infected group were lower than those of the control group (P < 0.0001). The results of qRT-PCR showed that the mRNA of key molecules in the Wnt signaling pathway was expressed in different degrees. The expression levels of β-catenin in control group, 680 umol/LNaF group, 1360 umol/LNaF group and 2720 umol/LNaF group were (1.00 ± 0.73, 1.02 ± 0.23, 5.48 ± 0.72 and 2.94 ± 0.10, respectively), c-myc (1.00 ± 0.78, 1.96 ± 0.94, 3.34 ± 0.75, 3.83 ± 0.25), CyclinD1 (1.00 ± 0.95, 0.98 ± 0.24, 12.36 ± 0.97, 1.05 ± 0.13), Dvl-1 (1.00 ± 0.64, 1.51 ± 0.24, 37.54 ± 0.33, 18.96 ± 0.26); control group, low dose group and medium dose group increased with the concentration of exposure. The expression of β-catenin, CyclinD1, c-myc, Dvl-1 mRNA in Wnt/β-catenin signaling pathway increased; The high dose group decreased; By one-way ANOVA, β-catenin (F = 8.16, P = 0.008) was obtained. c-myc (F = 4.34, P = 0.043); CyclinD1 (F = 6.48, P = 0.016); Dvl-1 (F = 41.90, P < 0.001); After t test between the two groups, compared with the control group, there was no statistical significance in the low-dose group (t = 1.741, t = 1.866, t = 1.108, t = 3.708, P > 0.05), and there was statistical significance in the medium-dose and high-dose groups (P < 0.05). There was significant difference between medium dose group and low and high dose group (P < 0.05). Conclusion: AC16 cells were successfully modelled after fluoride staining, and the survival rate of cardiomyocytes could be affected by different concentrations of NaF. Low and medium doses of fluoride may cause myocardial cell injury through Wnt/β-catenin signaling pathway, and increase mRNA expression of β-catenin, CyclinD1, c-myc and DVL-1. The mRNA expressions of fluoro-β-catenin, CyclinD1, c-myc and DVL-1 were decreased at high doses, which may be due to the over-activation of Wnt signaling pathway, but the damage to cardiomyocytes was reduced.

1. 引言

氟作为一种重要的微量元素，其普遍分布于自然环境中，对骨骼、牙齿及非骨相组织的影响尤为显著[1]。氟化物的适量摄入可以有效预防龋齿，而且通过服用氟保护剂，还能够显著改善儿童的龋齿[2]状况，降低其龋齿发病机率，从而达到预防龋齿的目的，但如果氟的摄取量超出了安全范围，就会导致慢性氟中毒，从而对患者的日常生活质量造成严重影响。

Wnt信号通路的异常调控机制已证实与多种疾病的发病机制密切相关，包括心血管系统疾病、骨关节病变以及肝脏疾病等领域[3]-[6]。该通路的标志是β-catenin在细胞质中的累积，并转移至细胞核内，β-catenin是一个定位于胞浆的可溶性蛋白，其在细胞质中的浓度决定了Wnt信号通路的开放或关闭[7]，游离的β-catenin可进入细胞核，调节下游靶基因的表达，在正常细胞中通常没有Wnt信号，β-catenin的表达维持在低水平，且多以cadherin-actin复合体形式存在于胞膜[8]。Dvl-1可调节细胞增殖，接受上游分子信号，并抑制β-catenin的降解[9] [10]。c-myc与CyclinD1均为下游Wnt信号靶基因，调控细胞生长，c-myc是一种原癌基因，其在干细胞自我更新调控以及肿瘤的发生发展中扮演者重要的角色。CyclinD1是一种细胞周期蛋白，促进细胞增殖，在细胞周期中被首先合成，其复合物CyclinD1-CDK4复合物在核膜上积累，然后转运至细胞核，在核膜、细胞核、细胞质中均有存在[11] [12]。近年来Wnt/β-catenin信号通路研究非常广泛，而氟致心肌损伤该通路的研究较少，因此本研究通过体外培养AC16，氟化钠染毒造模，观察其对人心肌细胞Wnt信号通路β-catenin、CyclinD1、c-myc、Dvl-1 mRNA的表达水平，为后期研究过量氟致心肌损伤作用提供理论基础。

2. 材料与方法

2.1. 细胞和主要试剂

2.1.1. 细胞株

AC16人心肌细胞(购买于上海富衡生物科技有限公司)。

2.1.2. 主要试剂

氟化钠(NaF；分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；AC16完全培养基(上海富衡生物科技有限公司)；0.25%胰蛋白酶消化液(武汉塞维尔生物科技有限公司)；CCK-8试剂(武汉塞维尔生物科技有限公司)；高糖DMEM培养基(武汉塞维尔生物科技有限公司)；细胞冻存液(江苏凯基生物技术有限公司)；巴氏吸管(西安恩典生物有限公司)；动植物RNA提取试剂盒(北京全式金生物有限公司)；逆转录试剂盒(北京全式金生物有限公司)；实时荧光定量试剂盒(北京全式金生物有限公司)。

2.1.3. 主要仪器

全自动酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)；倒置荧光显微镜(舜宇光学科技集团有限公司)；CO₂培养箱(美国赛默飞世尔科技公司)；培养瓶(美国Coring公司)；96孔板(美国Coring公司)；超净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；恒温水浴锅(杭州庚雨仪器有限公司)；低温冰箱(美国赛默飞世尔科技公司)；电子天平(天津西纳智能科技有限公司)；离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司)；实时荧光定量PCR仪(美国赛默飞世尔科技公司)。

2.2. 细胞培养与造模

2.2.1. 细胞传代

AC16人心肌细胞培养于AC16 DMEM完全培养基中，置于37℃、5% CO₂无菌恒温细胞培养箱中培养，每日对细胞形态及贴壁状况进行观察，待AC16贴壁细胞汇合度达到90%时，将AC16进行传代。1 × PBS洗涤细胞2次，加入0.25%胰蛋白酶消化液1 mL，置于37℃、5%的CO₂恒温培养箱中消化2 min，置于倒置荧光显微镜中观察其细胞状态，待观察到细胞变圆变亮时，加入4~5 mL AC16 DMEM完全培养基终止消化，无菌巴氏吸管轻轻吹打细胞，将其转移至15 mL无菌无酶离心管中，1000 rpm，离心5 min，吸去上清液，加入2 mL AC16 DMEM完全培养基制成单细胞悬液，均匀分装至两个新的T25培养瓶中，补足AC16 DMEM完全培养基至5 mL，混匀进行第二代培养，并以此类推。

2.2.2. NaF染毒细胞造模

称取NaF溶于高糖DMEM培养基中，配制成10 mmol/L的母液，用滤头过滤。取AC16完全培养基配置成不同浓度NaF溶液。分别为对照组、680 umol/LNaF组、1360 umol/LNaF组、2720 umol/LNaF组。

2.2.3. 细胞形态观察

取出染毒24 h后的AC16人心肌细胞，置于倒置荧光显微镜下观察细胞形态。

2.2.4. CCK-8孵育及细胞存活率测定

取生长态势良好，汇合度为90% AC16细胞胰酶消化后，1000 rpm，离心5 min，细胞沉淀用完全培养基制成5 × 10⁴/mL的单细胞悬液接种于96孔板中，每孔吸取100 ul单细胞悬液，即每孔中接种5 × 10³个细胞，放置于37℃，5% CO₂培养箱中培养24 h贴壁后，弃去原培养液，分别加入含有不同浓度680 umol/L、1360 umol/L、2720 umol/L的NaF配置成的完全培养基100 ul，并设置空白对照组，每个浓度设3个复孔。培养24 h后，各孔加入10 ul混合好的CCK-8试剂(CCK-8试剂：DMEM = 1:10)置于37℃，5% CO₂培养箱中避光培养45 min，放置于全自动酶标仪上，于450 nm波长处测定吸光度(A)值，实验重复3次，计算细胞毒性活力。细胞毒性活力(%) = (染毒组A值 − 空白组A值)/(对照组A值 − 空白组A值) × 100%。

2.2.5. qRT-PCR法检测mRNA的表达情况

收集染毒24 h的细胞，采用全式金柱提法提取细胞总RNA，用酶标仪测定RNA的纯度，确保A260/A280在1.8~2.0之间，以保证RNA的质量；逆转录试剂盒将RNA逆转为cDNA，进行qRT-PCR检测。结果按照2^−ΔΔCt计算基因相对表达水平，以GAPDH为内参基因，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，引物序列详见表1。

Table 1. Real-time primer sequences

表1. 实时荧光定量引物序列

基因	上游	下游
Dvl-1	GAGGGTGCTCACTCGGATG	GTGCCTGTCTCGTTGTCCA
β-catenin	CCTATGCAGGGGTGGTCAAC	CGACCTGGAAAACGCCATCA
c-myc	GGATTCTCTGCTCTCCTC	CTTGTTCCTCCTCAGATC
CyclinD1	GTGAAGGCGCTATTTGGCG	TGGTTGCTCATAATCACTGCC
GAPDH	GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT	GGCTGTTGTCATACTTCTCATCG

2.3. 统计学分析

所有实验重复3次以上，结果采用$\overline{x}\pm s$ 表示。采用Graphpad primer 9.5.1软件进行统计分析并作图，两组之间的比较用t检验；多组间比较采用方差齐性检验(normality and lognormality test)和单因素方差分析(One-Way ANOVA)，进一步进行组间两两比较，若方差齐时，采用一般的方差分析；若方差不齐时，需校正，检验水准α = 0.05。

2.4. 质量控制

实验时购买的试剂确保为品质优良的试剂；实验前确保AC16人心肌细胞均处于对数生长期，有良好的细胞活性；细胞培养过程中，保持实验室干净、整洁；超净工作台正常运行，避免细胞污染；实验过程中严格按照试剂盒说明书及实验室操作规范进行操作，将随机误差降低；每个实验至少做3个平行样品，每个实验均重复做3次。

3. 结果

3.1. AC16细胞形态及凋亡情况

NaF染毒处理AC16人心肌细胞24 h后，对照组人心肌细胞形态整呈长梭形，具有完整细胞膜和细胞质，生长状况良好且生长密度高；680 umol/LNaF染毒组在镜下可见大量呈圆形，细胞质固缩的死亡细胞，其中活细胞的形态也逐渐由梭形变成不规则形，且细胞体积变小；1360 umol/LNaF组、2720 umol/LNaF组亦出现相同情况，2720 umol/LNaF组细胞体积较680 umol/LNaF组细胞体积更小，生长密度减少，显微镜下出现少部分死细胞，见图1。

对照组 680 umol/L染毒组

1360 umol/L染毒组 2720 umo/L染毒组

Figure 1. Cell morphology in different NaF groups

图1. 不同NaF组细胞形态

3.2. CCK-8检测结果

不同浓度NaF染毒AC16细胞24小时后，对照组存活率分别为(100 ± 0.08)%，氟染毒组细胞存活率较对照组逐渐降低，680 umol/LNaF组存活率为(83.66 ± 0.06)%、1360 umol/LNaF组存活率(42.75 ± 0.07)%、2720 umol/L NaF组存活率(31.75 ± 0.02)%，经单因素的方差分析，得出(F = 168.97, P < 0.001)差异有显著性，见表2。经Graphpad Prism 9.5.1分析后，细胞存活率变化见图2。

注：^*：P < 0.05，^***：P < 0.001；^****：P < 0.0001。

Figure 2. Effect of different concentrations of NaF on cell viability ($\overline{x}\pm s$ , n = 4)

图2. 不同浓度NaF对细胞存活率的影响($\overline{x}\pm s$ , n = 4)

Table 2. Effect of different concentrations on the viability of AC16 cells ($\overline{x}\pm s$ , n = 4)

表2. 不同浓度对AC16细胞存活率的影响($\overline{x}\pm s$ , n = 4)

NaF浓度(umol/L)	细胞存活率(%)
0	100 ± 0.08
680	83.66 ± 0.06^a
1360	42.75 ± 0.07^ab
2720	31.75 ± 0.02^abc
F值	168.97
P值	<0.001

注：^a与对照组相比，P < 0.05；^b与680 umol/LNaF组相比，P < 0.05；^c与1360 umol/LNaF组相比，P < 0.05。

3.3. NaF染毒后β-Catenin、c-myc、CyclinD1、Dvl-1 mRNA表达情况

NaF染毒AC16细胞24 h后，染毒组与对照组相比β-catenin、c-myc、CyclinD1、Dvl-1 mRNA表达水平增加，对照组、680 umol/LNaF组、1360 umol/LNaF组、2720 umol/LNaF组中β-catenin表达量分别为(1.00 ± 0.73, 1.02 ± 0.23, 5.48 ± 0.72, 2.94 ± 0.10)、c-myc (1.00 ± 0.78, 1.96 ± 0.94, 3.34 ± 0.75, 3.83 ± 0.25)、CyclinD1 (1.00 ± 0.95, 0.98 ± 0.24, 12.36 ± 0.97, 1.05 ± 0.13)以及Dvl-1 (1.00 ± 0.64, 1.51 ± 0.24, 37.54 ± 0.33, 18.96 ± 0.26)；经单因素方差分析可得，β-catenin (F = 8.16, P = 0.008)；c-myc (F = 4.34, P = 0.043)；CyclinD1 (F = 6.48, P = 0.016)；Dvl-1 (F = 41.90, P < 0.001)经t检验显示，与对照组相比，β-catenin低剂量组为(t = 1.74, P > 0.05)、β-catenin中剂量组为(t = 3.13, P < 0.05)、β-catenin高剂量组为(t = 10.64, P < 0.05)；c-myc低剂量组为(t = 1.87, P > 0.05)、c-myc中剂量组为(t = 3.13, P < 0.05)、c-myc高剂量组为(t = 10.64, P < 0.05)；CyclinD1低剂量组为(t = 1.02, P > 0.05)、CyclinD1中剂量组为(t = 3.13, P < 0.05)、CyclinD1高剂量组为(t = 10.64, P < 0.05)；Dvl-1低剂量组为(t = 3.71, P < 0.05)、Dvl-1中剂量组为(t = 3.13, P < 0.05)、Dvl-1高剂量组为(t = 10.64, P < 0.05)。随NaF浓度的增加，细胞中β-catenin、cyclinD1、Dvl-1、c-myc mRNA呈现先升后降的趋势，2720 umol/LNaF组中反而呈现降低趋势，见表3。经Graphpad Prism 9.5.1分析后，β-catenin、CyclinD1、Dvl-1、c-myc mRNA表达变化见图3。

Figure 3. Effects of different concentrations of NaF on the mRNA expression of β-catenin, c-myc, CyclinD1 and Dvl-1 in cells ($\overline{x}\pm s$ , n = 3)

图3. 不同浓度NaF对细胞中β-catenin、c-myc、CyclinD1、Dvl-1 mRNA表达的影响($\overline{x}\pm s$ , n = 3)

Table 3. mRNA expression of β-catenin, c-myc, CyclinD1 and Dvl-1 in AC16 cells after NaF contamination ($\overline{x}\pm s$ , n = 3)

表3. NaF染毒后AC16细胞中β-catenin、c-myc、CyclinD1、Dvl-1 mRNA表达情况($\overline{x}\pm s$ , n = 3)

NaF浓度(umol/L)	β-catenin	c-myc	cyclinD1	Dvl-1
0	1.00 ± 0.733	1.00 ± 0.776	1.00 ± 0.949	1.00 ± 0.636
680	1.02 ± 0.23	1.96 ± 0.94	0.98 ± 0.24	1.51 ± 0.24^a
1360	5.48 ± 0.72^ab	3.34 ± 0.75^ab	12.36 ± 0.966^ab	37.54 ± 0.33^ab
2720	2.94 ± 0.10^ab	3.83 ± 0.25^ab	1.05 ± 0.13^ab	18.96 ± 0.26^abc
F值	8.16	4.34	6.48	41.90
P值	0.008	0.043	0.016	<0.001

注：^a与对照组相比，P < 0.05；^b与680 umol/LNaF组相比，P < 0.05；^c与1360 umol/LNaF组相比，P < 0.05。

4. 讨论

研究发现，氟对心肌系统损伤有较为严重的影响[13]。氟可干扰三羧酸循环的正常运行，而人体中心肌消耗能量大，而ATP储存少，从而导致心脏收缩功能减弱。吴起清[14]的研究表明，氟中毒大鼠的Q-T间期明显缩短，大鼠心电图异常。羡海英[15]等人发现氟中毒会导致大鼠心肌组织产生明显的病变，正常的心肌组织中，心肌纤维排列整齐；在轻微氟中毒的心肌组织中，心肌组织间隙的宽度稍有增加，并且伴随轻度的血管扩张；中度氟中毒的心肌组织中，心肌组织间隙的宽度则明显增加，肌肉排列开始出现异常，组织间隙血管扩张明显；严重氟中毒的心肌组织中，心肌组织的间隙宽度显著增加，甚至一些心肌纤维会出现溶解、凝固的现象。通过对日本某地区村庄中居民心电图的研究发现，当氟化物的水平介于0.5~6.2 mg/L之间时会导致心肌损伤加重，并且其与牙釉质的斑驳缺损之间存在直接关系[16]。

活性氧增加可以导致心脏疾病的风险增加[17] [18]。细胞层面研究显示，氟化物可以诱导大鼠H9C2细胞活性氧产生增多。并可能激活JNK信号通路诱导心肌细胞损伤，对心肌组织产生严重损害[19]。谢佳鑫[20]等人通过基因转录和蛋白组学分析表明，长期氟暴露诱导心肌收缩信号通路相关基因差异性表达，参与发生心脏疾病的通路中的Acta2和Tnni3以及调节细胞内外离子平衡的RyR2和ATP1a1等蛋白可能是氟致心肌收缩障碍的关键蛋白。长期氟化物暴露后，心肌中的IL-17、MMP-9和Caspase-3显著升高，氟化物似乎诱发了心脏组织的炎症，以及组织钙的增加，慢性氟化物暴露后，心肌纤维受到严重损害，包括变薄、变形和新血管生成[21]。高剂量的氟化物会扰乱与caspase-8介导的细胞凋亡有关的心肌纤维的排列[22]。流行病学调查发现，氟化物流行地区普通人群血压升高的风险增加[23]。本研究表明，NaF侵染人心肌细胞24 h，人心肌细胞由梭形变成不规则形，且细胞体积变小，少量细胞出现死亡。说明NaF对细胞产生毒性，导致了心肌细胞的死亡。

Wnt/β-catenin信号通路是一条经典的Wnt信号通路，是细胞传导中的关键途径之一，参与调控机体内多种细胞的增殖、分化、极化、迁移及凋亡的过程[24]。Wnt信号通路在心脏损伤中亦发挥着重要的作用，SHEN等[25]则证实，Wnt3a预处理可减少老年小鼠急性心梗模型中梗死面积、增强其心功能，增加老年缺血缺氧模型心肌细胞活力；β-catenin的激活参与压力超负荷介导的心脏肥大和纤维化，WANG等[26]研究发现，LRP6 (低密度脂蛋白受体相关蛋白6)过表达显著抑制了β-catenin的活化，上调组织蛋白酶D促进Wnt5a和Wnt11的降解，改善心脏纤维化，防止压力负荷下心脏不良重塑。人心肌细胞(AC16)是研究心肌发育良好的细胞模型，本研究表明，NaF侵染AC16后，Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin、CyclinD1、Dvl-1、c-myc等关键分子mRNA随NaF浓度的升高呈现出先升后降的趋势，Wnt/β-catenin被激活后，低、中浓度氟可能通过该通路诱导心肌细胞的损伤，而高浓度氟则可能由于该通路的过度激活而受到抑制。这与何欢[27]等人在NaF对成骨细胞MC3T3-E1的分化及Wnt信号转导通路的影响的研究中，亦出现高剂量NaF下调β-catenin、Lrp5蛋白表达水平，进而抑制Wnt通路信号转导通路，影响细胞分化的结论相似；也与陈锡山[28]在Wnt经典信号通路在慢性氟中毒大鼠骨骼损伤中作用机制的研究中发现，高氟组Wnt3a蛋白质和β-catenin蛋白表达高于低氟组表达，差异有统计学意义(P < 0.05)，抑制了Wnt经典信号通路研究结果相似。因此，基于本研究的结果，下一步将考虑高浓度氟是如何对该通路的过度激活而受到抑制成为研究重点。

作者贡献声明

朱世玲：实施研究，撰写论文；张强：论文修改与指导、经费支持；杨瑞、赵亚倩：资料整理，开题指导；沈洪婷：实验指导，数据分析。

基金项目

第二次青藏高原综合科学考察研究阶段性成果，项目编号：2019QZKK0607。

NOTES

^*通讯作者。