1. 引言
阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease, AD)是一种渐行性的神经退行性疾病，以认知、情感、语言和记忆力进行损害为特征。近年来阿尔茨海默病患者逐年增多，给社会造成了巨大压力目前，阿尔茨海默病的治疗方法有限，缺乏有效的治疗药物。人参作为传统中药，具有滋补强壮、益智健脑的功效，近年来研究发现其可能对阿尔茨海默病具有一定的治疗作用。然而，人参治疗阿尔茨海默病的具体作用机制尚不明确。因此，本研究旨在通过网络药理学与分子对接技术，探究人参治疗阿尔茨海默病的作用机制，为阿尔茨海默病的防治提供新的思路和理论基础。
2. 方法
2.1. 人参主要成分的筛选
人参主要成分的筛选运用TCMSP数据库[1] (https://tcmspw.com/tcmsp.php)，以“人参”为关键词检索其活性成分，检索人参中所含化合物的口服生物利用度(Oral bioavailability, OB)及类药性(Drug-likeness, DL)，以OB ≥ 30%和DL ≥ 0.18为阈值进行筛选。筛选得到10个关键成分，由于其中两个成分受技术限制无法查询到其靶向基因，因此剔除，最终得到八个关键成分。
2.2. 人参主要成分靶点获取
利用TCMSP、pubchem [2] (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和SWISS TargetPrediction数据库[3] (http://www.swisstargetprediction.ch/)预测人参主要成分靶点。通过pubchem获得主要成分的SMILE name，通过SWISS TargetPrediction获取“Probability > 0”的单个成分的GENE name。
2.3. 疾病靶点获取
分别通过GeneCards数据库[4] (http://www.genecards.org/)及GeNET数据库，以“Alzheimer disease”为关键词进行检索，并对两个数据库的检索结果取交集，作为阿尔茨海默病的相关靶点。
2.4. 药物–成分–基因靶点网络构建
将阿尔茨海默病相关靶点与人参主要成分的作用靶点进行对比，取二者交集(共同靶点)，即为人参治疗阿尔茨海默病的潜在作用靶点。并基于Cytoscape软件构建“药物–成分–基因靶点网络”。
2.5. 互作靶点的PPI网络构建
基于STRING数据库[5] (https://string-db.org/)对人参治疗阿尔茨海默病的潜在作用靶点进行PPI分析，将药物–疾病互作靶点导入后，minimum required interaction score设置为0.7 (high confidence)，构建PPI蛋白互作网络图，并进行Cytoscape可视化，基于可视化结果筛选连接度前n的蛋白。
2.6. 互作靶点的GO、KEGG分析
利用R语言，对药物–疾病互作靶点进行KEGG及GO分析，得到富集分析结果[6]。
GO数据库是分别从细胞组分(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)、生物过程(biological process, BP)对基因产物进行了标准化描述。GO富集分析是对基因进行简单注释，进而了解差异基因富集在哪些生物学功能、途径或者细胞定位。所以GO是功能注释，即每个基因可能参与哪些pathway terms或者GO terms。GO分析得到的是一条条的线路(GO term)，每一个线路里面有自己的基因集，且彼此之间没有任何联系。
KEGG是网状的，是由前期研究发现的一条条的代谢通路组成的网状的结构，KEGG也有基因集，但更侧重于代谢通路的研究。KEGG是功能富集，即基因(或多个基因)可能显著地集中在哪些通路上的富集。类似的通路数据库有wikipathway，reactome等。
2.7. 分子对接技术初步验证成分与靶点基因的关系
基于Python环境，进行药物主要成分(大分子)与相关疾病靶点(小分子)的分子对接，预测主要成分与互作靶点的分子结合模式及结合力强弱。
通过数据库下载筛选出主要成分及互作靶点的分子结构，使用Pymol进行分子配体及水分子的去除，保留关键结构，减轻混杂因素的干扰。对小分子结构进行预处理及格式转换。通过选择file-re阿尔茨海默病molecule打开预处理后的蛋白结构，选择edit-hydrogens-add，在弹出的窗口中点击OK，选择grid-macromolecule-choose将蛋白保存为pdbqt文件。打开小分子，以同样的步骤对其进行加氢，选择Ligand-input-choose-select molecula for autodock4，选择Ligand-output将其保存为pdbqt文件。打开上一步保存的小分子pdbqt文件后设置对接盒子：选择grid-grid box，在弹出的窗口中调节滚轮和spacing数值使盒子完全包裹住蛋白，设置完成后保存对接盒子文件。点击docking-macromolecule-set rigid filename选择pdbqt蛋白文件，点击docking-ligand-choose选择小分子点击接受。点击docking-search parameters-genetic algorithm，弹出的窗口是对接参数，第一个选项对接次数设置为60次，其他参数按照默认设置。运行对接后保存对接结果文件。
2.8. 互作靶点与阿尔茨海默病之间的孟德尔随机化分析
对于互作靶点与阿尔茨海默病之间的因果关系通过Two Sample MR包实现，使用逆方差加权分析法(inverse variance weighted, IVW)为主要分析方法，当所选SNP均为有效工具变量时，IVW方法结果具有较高准确性。首先使用“mr_singlesnp”获取单个SNP的结果，然后使用“mr_forest_plot”绘制森林图，得到每个SNP的因果效应估计值及其置信区间；使用“mr_funnel_plot”绘制漏斗图，评估SNP的异质性；使用“leave-one-out”进行敏感性分析，评估每个SNP对整体MR效应的稳定性；最后使用“mr_scatter_plot”函数绘制散点图，揭示暴露因子与结局变量存在的一定的因果关系。
3. 结果
3.1. 人参活性成分及靶点
通过TCMSP数据库得到的活性成分以口服生物利用度(oral bioavailability, OB)、类药性(drug likeness, DL)及类药五规则(rule of five，又称Lipinski规则)为指标进行筛选。通过TCMSP数据库得到的活性成分利用PubChem数据库进行分析再进行筛选。将筛选所得结果相结合得到8个人参主要成分基因，包括Celabenzine、Dianthramine、Frutinone A、Fumarine、Girinimbin、Inermin、kaempferol和suchilactone将其以RENSHEN1-8代称。
3.2. 药物–活性成分–基因靶点网络
通过TCMSP和PubChem数据库检索及筛选得到人参活性成分靶点361个。利用Cytoscape 3.8.2软件构建“药物–活性成分–基因靶点”网络(图1)。紫色圆形代表人参，灰色圆形代表有效成分，蓝色圆形代表关联靶点。
3.3. 疾病靶点及交集靶点
将检索GeNET和GeneCard数据库后得到的疾病靶点进行筛选后，最终得到疾病靶点1150个。活性成分靶点与疾病靶点取交集得到关键靶点121个(图2)。
3.4. PPI网络
将交集靶点导入String数据库分析PPI关系，构建可视化PPI网络(图3)。圆形代表基因表达的靶蛋白，颜色越深，面积越大，度值越大。边代表蛋白质之间的相互作用，线段由细到粗，PPI综合得分由低到高。PPI网络中CFTR、ERBB2、PIK3CA和EGFR的综合得分较高，说明各组蛋白间的相互作用能力较强。
Figure 1. Ginseng active ingredients-target network map
图1. 人参活性成分–靶点网络图
Figure 2. Intersection diagram of active ingredients of ginseng and Alzheimer’s disease targets
图2. 人参活性成分与阿尔茨海默病靶点交集图
Figure 3. Analysis of intersection target PPI between active ingredients of ginseng and Alzheimer’s disease
图3. 人参活性成分与阿尔茨海默病交集靶点PPI分析图
3.5. “药物–活性成分–互作靶点”网络
利用Cytoscape软件构建“药物–活性成分–关键靶点–疾病”网络(图4)。深蓝色代表人参，浅蓝色代表活性成分，绿色代表阿尔茨海默病与人参活性成分的互作靶点。
3.6. KEGG通路富集分析
利用DAVID v6.8数据库进行KEGG信号通路富集分析，得到19条相关通路。通过R语言对所得信号通路进行富集分析，并利用线圈图将其可视化，得到结果(图5)。结果显示，人参治疗阿尔茨海默病的靶点所富集的通路主要包括神经活性配体–受体的相互作用、Ras信号通路、多种细胞凋亡通路、MAPK信号通路等，推测这些通路为人参发挥治疗作用的关键通路。
Figure 4. Drug-active ingredient-interaction target map
图4. 药物–活性成分–互作靶点图
Figure 5. KEGG analysis results of interaction targets
图5. 互作靶点KEGG分析结果
3.7. GO功能富集分析
利用DAVID v6.8数据库对关键靶点进行GO功能富集分析，得到872个生物过程(biological process, BP)结果，55个细胞成分(cellular component, CC)结果，72个分子功能(molecular function, MF)结果。通过R语言进行关键基因群的GO分析，并利用线圈图将其可视化，得到结果(图6)，表明人参可通过多靶点–多通路作用于阿尔茨海默病。
Figure 6. GO analysis results of interaction targets
图6. 互作靶点GO分析结果
3.8. 分子对接
化合物与核心靶点的结合能越低，表明化合物与靶蛋白结合越稳定(表1)。由分子对接结果可知，人参与这些关键靶点之间具有良好的结合活性，表明人参可能通过作用于以上关键靶点来发挥抗阿尔茨海默病的作用。最后用Pymol软件对对接结果进行可视化(图7)。
Table 1. Molecular docking binding energy
表1. 分子对接结合能
Target |
PDB ID |
Binding energy |
DRD3 |
3PBL |
−8.5 |
ERN1 |
6W39 |
−8.8 |
FGFR1 |
5EW8 |
−10.1 |
MIF |
1CA7 |
−8.9 |
MMP8 |
1I76 |
−8.6 |
MMP9 |
5CUH |
−9.6 |
MTOR |
3FAP |
−9 |
PIK3CA |
5UBR |
−8.9 |
RAF1 |
6xi7 |
−9.3 |
Figure 7. Molecular docking visualization results
图7. 分子对接可视化结果图
3.9. 互作靶点与阿尔茨海默病之间的孟德尔随机化分析
基于孟德尔随机化分析，验证互作靶点与阿尔茨海默病之间的因果关系。在MR分析中，我们以互作靶点的基因为暴露因素、以阿尔茨海默病为结局，将121个关键互作靶点全部纳入分析，F统计量值均大于10，进行孟德尔随机化分析结果表明互作靶点与阿尔茨海默病之间存在一定的因果关系(图8，图9)。
4. 讨论
4.1. 中医视角下的阿尔茨海默病
在《医学衷中参西录》中，虽无“阿尔茨海默病”这一现代术语，但与中医的“痴呆”“善忘”“呆病”等类似，病位在脑，涉及心、肾。其发病机制为年老脏腑虚衰，气血生化不足、精血亏虚致心血及
Figure 8. Mendelian randomization analyzes scatter plots
图8. 孟德尔随机化分析散点图
Figure 9. Mendelian randomized analysis funnel plot
图9. 孟德尔随机化分析漏斗图
髓海不充、元神失用，且脏腑功能减退致痰饮瘀血堆积影响神机[7]。《灵枢·天年篇》描述中老年人患阿尔茨海默病症状有行动迟缓、记忆障碍、痴呆，病因是内气虚不胜，为本虚标实之疾，传统中医将其分为肾精衰竭、肝肾阴虚、心脾两盛、痰阻血滞四种类型[8]。
4.2. 人参对阿尔茨海默病的作用
人参是五加科多年生草本植物，药用部位为根[9]，含人参皂苷、多糖等多种化学成分，是强壮滋补药，作用于心血管和中枢神经系统，可调整血压、恢复心脏功能、治疗神经衰弱和身体虚弱等，还有祛痰、健胃、利尿、兴奋等功效。TNF-α在老年人中参与病理反应促使炎症发生，是脑内淀粉样Aβ斑块形成原因之一，加快阿尔茨海默病病程，IL-1β存在于活化胶质细胞内且释放到细胞外有毒性作用，COX2和iNOS作为炎症诱导剂在阿尔茨海默病发育过程中有作用[10] [11]。人参增强学习记忆能力主要有效成分是Rb1和Rg1 [12]，人参皂苷Rg1能增加脑内Ach合成和M-胆碱受体密度[13]，人参皂苷Rb1可减轻神经毒性损害、抗炎、抗氧化，还能抑制大脑皮层中cNOS活性减少NO细胞毒作用。
4.3. 网络药理学对人参治疗阿尔茨海默病的分析
本文通过网络药理学方法，从数据库检索筛选得人参活性成分8个、作用靶点361个，其发挥治疗阿尔茨海默病药效的成分基因可能为Celabenzine、Dianthramine等。在PPI网络构建分析中，CFTR、ERBB2等前十位靶点与人参活性成分连接度高，分子对接结果显示核心靶点与关键活性成分结合力好。GO生物过程富集分析显示人参通过影响G蛋白耦联受体信号通路老化、神经递质受体活性等改变阿尔茨海默病发展。KEGG通路富集分析显示人参影响NF-κB等多条信号通路干预该病，NF-κB信号通路是代表性通路之一，其在人体中参与多种生理过程，与突触可塑性、学习记忆功能有关，其异常可导致炎症反应和自身免疫调节疾病，对阿尔茨海默病发生发展有重要推进作用[14]。
本研究通过网络药理学分析人参治疗阿尔茨海默病的主要活性成分、关键靶点和可能参与的信号通路，前期网络药理学与实验结果一致，符合中药“多途径–多方式–多靶点”[15]的治疗优势，为后续人参治疗阿尔茨海默病的相关药理学提供了参考。
基金项目
河北省2024大学生创新创业训练项目(NO.202410092006; NO.S202410092019)。
NOTES
*共同第一作者。
#通讯作者。