1. 背景
前列腺癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在世界范围内，其发病率高居男性肿瘤第2位，死亡率高居男性肿瘤第5位[1]。相比于西方和欧美国家，在中国，前列腺癌的发病率与死亡率稍低，均位于男性肿瘤第7 [2]。但随着筛查技术的进步与普及，前列腺癌的发病率呈现逐年上升的态势，且相较于西方欧美人群，趋势更快更高[3]。前列腺癌是一种异质性很高的癌种，在不同的人群中呈现出完全不同的进展情况，治疗方法也不尽相同。因此，前列腺癌的诊断与治疗亟需进一步的规范化和个体化。
蛋白质作为细胞组成的重要部分，是生物体内最重要的生物大分子之一，蛋白质在细胞中发挥许多关键的作用，包括催化反应(如蛋白酶)、细胞信号传递、免疫反应以及细胞的结构支持等[4]。此外，蛋白质的功能不局限于单个细胞，在生物体内调节注入激素和生长因子等生物过程，协助维持机体的稳定。因此，蛋白质是维持生命活动的核心分子，在前列腺癌的发生发展中起到了至关重要的作用。
TCGA数据库(The Cancer Genome Atlas)：是由美国国家癌症和肿瘤研究所(NCI)和国家人类基因组研究所(NHGRI)于2006年联合启动，目前已经有20多种组织类型的30多种癌症11,000多个病人的临床与基因表达信息[5]。其建立之初目的是理解癌症的分子机制，绘制癌症基因图谱，进而提高诊断、治疗和预防癌症的能力。目前这些信息全部开放供研究者下载使用，本文所需数据均来自TCGA数据库。
2. 研究方法
2.1. 材料收集与整理
以“TCGA-PRAD”关键词搜索，从GDC官网(https://portal.GDC.cancer.gov/)下载前列腺癌的蛋白表达谱、临床数据和转录组数据，使用perl软件整理文件，得到352位前列腺癌患者的蛋白表达信息和临床信息。整理临床数据时，将进展期前列腺癌患者(包括淋巴转移或骨转移)与死亡患者统归为不良预后结果。
2.2. 建立预测模型
通过R-studio建立预后预测模型，将352位前列腺癌患者随机分为实验组和测试组，使用单因素COX对实验组所有蛋白进行COX回归分析，符合条件的蛋白使用多因素COX回归分析，同种方法作用于测试组。当两组回归曲线的AUC均大于0.7时，输出多因素结果。
2.3. 评估差异风险基因
根据模型筛选出的蛋白表达情况，为每一位患者赋予Risk评分，评分的计算方法为
，其中exp表示蛋白质的表达量，β表示LASSO算法中患者的系数。以中位风险评分为临界值，将患者分为高危组和低危组进行随访分析选取Risk评分的中位数为截断值，将所有患者分为高低风险组。选取高低风险组为研究对象，对单因素筛选出的所有预后相关蛋白进行差异风险分析。使用“ggplot”R包对结果进行可视化，纵坐标为FDR，横坐标为差异倍数。
2.4. 主成分分析
为了评估高低风险组分类器效果，使用PCA (principal component analysis)分析[6]方法进行处理。根据模型结果将352位前列腺癌患者分为高低风险两组，对前列腺癌患者的所有蛋白以及风险蛋白进行分析，使用“scatterplot3d”R包将结果可视化，得到两组结果的3D PCA图。
2.5. 生存分析
使用“survival [7]”包中的fit函数，针对实验组、测试组以及所有患者的高低风险组，进行生存分析，结果使用Kaplan-Miere曲线[8]表示结果。其中，纵坐标为总体生存率，横坐标为生存时间。接下来，我们使用同种方法，二分类法将所有患者分为单个模型蛋白的高低表达组，进行生存分析，同样对结果可视化处理。
2.6. 独立预后分析
为了进一步评估模型效能，针对Risk评分、年龄、T分期、N分期，使用单因素COX回归分析评估他们的风险系数(HR) [9]，同种方法作用于多因素COX回归分析。所得结果以森林图样式显示，选取95%置信区间，并显示他们的P值。
2.7. ROC曲线
受试者操作曲线所围成的曲线下面积(AUC) [10]作为一种良好的模型预测指标，分别评估模型在横向跨度(1、3、5年生存期)以及纵向指标(Risk评分、年龄、T分期、N分期)上的预测效能。其中，横坐标为特异程度，纵坐标为敏感程度，将结果输出为图表。
2.8. Nomogram图
Nomo图[11]是根据模型现有参数，为不同临床性状赋予评分，根据评分之和可预测相对应的1、3、5年生存期，进而指导前列腺癌患者的个体化治疗，主要用来评估预测模型。使用“rms”包进行分析，使用“regplot”包分别做出校准曲线和Nomo图。
3. 研究结论
3.1. 建立前列腺癌的预后模型
使用上述建模方法，单因素COX回归筛选预后相关蛋白质，所得结果如图1(A)所示，共得到21个生存相关蛋白质。其中，共17种蛋白质HR > 1，代表它们与不良预后有关。将单因素结果进行LASSO回归，避免数据过拟合，进一步筛选变量，不同危险因素的LASSO系数路径图1(B)和交叉验证曲线图1(C)如下所示，LASSO所得的风险系数以及多因素COX回归筛选后共得到b-Actin、JNK_pT183Y185、MEK1、IRF-3_pS396四种预后相关蛋白质，使用它们来计算Risk评分，根据Risk评分高低将所有患者分为高低风险组，建立预后模型进而继续后续分析。
Figure 1. (A) Univariate COX regression analysis; (B) LASSO coefficient path plot; (C) LASSO regularization plot
图1. (A) 单因素COX回归分析；(B) LASSO系数路径图；(C) LASSO正则化路径图
3.2. 评估模型的预后价值
使用差异分析筛选高低风险组的不同风险蛋白，风险倍数log2化，取2为截断值，显示所有具有差异的蛋白质，FDR均大于1。将模型基因标注在图2(A)中，可以看到b-Actin、MEK1两种蛋白在高风险组中显著下调，JNK_pT183Y185、IRF-3_pS396两种蛋白在高风险组中显著上调，这表明前者可能是机体的保护因素，后者可能与不良预后有关，是健康的危险因素。接下来，我们进一步使用了主成分分析，所得结果在图2(B)~(C)中。比较所有蛋白与模型风险蛋白分组，可以看出模型蛋白在高低风险组中具有内在的相似度，其表达模式具有潜在的联系，这表明使用Risk评分作为分类器具有良好的效能。最后，生存分析进一步判断高低风险组的生存情况，如图2(D)~(F)所示，在测试集、实验集以及所有患者中，使用Risk作为分类器划分的高低风险组中，高风险组的生存期以及生存率均显著小于低风险组，这表明我们的模型可以用来预测患者的生存期。此外，针对四种模型蛋白质，我们分别针对每一种模型蛋白的高低表达组作为分类器，进行生存分析，可视化结果如图2(H)~(K)。b-Actin、MEK1高表达组的生存期显著高于低表达组，JNK_pT183Y185、IRF-3_pS396高表达组的生存期显著低于低表达组，这与前文的HR差异分析结果相一致，进一步明确了模型蛋白的预后价值。
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
![]()
Figure 2. (A) Differential risk coefficient plot of high and low-risk groups; (B) Principal component analysis plot of high and-risk patients based on the distribution of all proteins; (C) Principal component analysis plot of high and low-risk patients based on the distribution of model proteins; (D) Kaplan-Meier survival curves of high and low-risk groups in the test set; (E) Kaplan-Meier survival curves of high and low-risk in the experimental set; (F) Kaplan-Meier survival curves of high and low-risk groups in all patients; (H) Kaplan-Meier survival of high and low expression groups of b-Actin protein; (I) Kaplan-Meier survival curves of high and low expression groups of MEK1; (J) Kaplan-Meier survival curves of high and low expression groups of IRF-3_Ps396 protein; (K) Kaplan-Mier survival curves of high and low expression groups of JNK_pT183Y185 protein
图2. (A) 高低风险组的差异风险系数图；(B) 依据所有蛋白质的分布在高低风险组患者中的主成分分析图；(C) 依据模型蛋白的分布在高低风险组患者中的主成分分析图；(D) 测试集高低风险组患者的生存曲线；(E) 实验集高低风险组患者的生存曲线；(F) 所有患者高低风险组患者的生存曲线；(H) b-Actin蛋白高表达组和低表达组患者的生存曲线；(I) MEK1蛋白高表达组和低表达组患者的生存曲线；(J) IRF-3_Ps396蛋白高表达组和低表达组患者的生存曲线；(K) JNK_pT183Y185蛋白高表达组和低表达组患者的生存曲线
3.3. 验证模型与使用模型
COX回归曲线与ROC曲线被用来验证模型的先进性。首先，我们对不同临床性状使用了单因素COX，年龄、T分期、N分期以及Risk评分作为自变量评估风险系数，所得结果如图3(A)所示，只有Risk评分的结果在统计学上有意义，P < 0.001。接下来，进一步使用多因素COX评估，所得结果与单因素相一致，如图3(B)所示。这表明，我们所使用的Risk评分系统是前列腺癌的独立预后因素，具有评估前列腺癌预后的价值。最后，ROC曲线被用来验证横向和纵向跨度上模型的优越性，AUC均大于0.65。其中，时间ROC曲线如图3(C)，针对1年的评估效能最好，3年次之，5年预测准确率稍差。临床性状ROC如图3(D)，Risk评分系统明显优于其他临床性状。建立、评估与验证模型之后，针对模型的使用，我们分析了Nomo图，如图3(E)所示，所有临床性状被赋予打分，根据临床性状打分之和用来预测前列腺癌患者的1、3、5年生存率。Nomo图的验证校准曲线如图3(F)所示。
Figure 3. (A) Univariate COX regression for different clinical features; (B) Multivariate COX regression for different clinical features;C) ROC curves for different clinical features; (D) ROC curves for 1, 3, and 5-year time points; (E) Nomo for prostate cancer patients; (F) Calibration curve for the nomogram
图3. (A) 针对不同临床性状的单因素COX回归；(B) 针对不同临床性状的多因素COX回归；(C) 针对不同临床性状的ROC曲线；(D) 针对1、3、5年时间的ROC曲线；(E) 前列腺癌患者的Nomo图；(F) Nomo图的校准曲线
4. 研究结果与讨论
通过本研究构建基于蛋白组学数据的前列腺癌预后模型，不仅帮助我们识别了b-Actin、MEK1、JNK_pT183Y185、IRF-3_pS396四种蛋白质作为新的生物标志物，还能在临床实践中提供重要的预后信息。通过分析蛋白质表达模式与患者生存期、疾病进展等临床结局之间的关系，我们能够为前列腺癌患者提供个体化的预后评估。JNK_pT183Y185、IRF-3_pS396的高表达可能提示肿瘤侵袭性较强，患者预后较差；而b-Actin、MEK1的低表达可能与较好的预后相关。
此外，前列腺癌的预测模型不仅限于生存预测，还可以为临床治疗方案的选择提供依据。对于高风险患者，可能需要更加积极的治疗干预，如手术治疗、化疗或放射治疗；而低风险患者则可以选择监测观察或轻度干预，如药物去势治疗等。通过对预后模型的精准应用，能够有效提高治疗的精确性，避免不必要的过度治疗，降低患者的治疗负担，提高生活质量。
尽管基于TCGA数据库的蛋白组学预后模型在前列腺癌研究中取得了显著的成果，但仍然存在一些局限性。首先，TCGA数据库中包含的数据主要来自美国等特定地区，可能存在一定的种族和地域偏差。其次，蛋白组学数据的异质性较大，不同实验平台和样本的差异可能会影响数据的可比性和一致性。因此，在未来的研究中，除了扩大样本量，还需要进行多中心、跨区域的验证，以提高模型的普适性和可靠性。
综上所述，基于TCGA公共数据库的蛋白组学数据，结合生物信息学分析工具，我们成功构建了前列腺癌的预后模型。通过对蛋白质表达模式的深入分析，我们不仅揭示了与前列腺癌预后相关的潜在标志物，还为临床实践提供了有价值的参考依据。然而，模型的建立仍面临着数据异质性、样本规模以及算法选择等方面的挑战，未来的研究可以通过多中心、跨组学的数据整合和机器学习技术的应用，进一步提升前列腺癌预后模型的准确性和临床实用性。
基金项目
2023年度安徽省高校自然科学研究项目，项目编号：2023AH053161。
NOTES
*通讯作者。