摘要: 文章采用表面离子共振技术，建立了以VP28重组蛋白为靶点的抗白斑综合征病毒药物筛选平台，并对40味中草药进行了针对VP28重组蛋白结合活性的研究。结果显示：40味中草药中有14味中草药对VP28重组蛋白有明显结合力，含有结合VP28重组蛋白的活性成分分别为诃子、连翘、大黄、黄柏、苏木、白芍、紫花地丁、地榆、夏枯草、金银花、迷迭香、大青叶、黄连、黄芩。其中诃子含有的活性成分结合力最强，KD值为1.601 × 10
−9，黄连的活性成分含量最高，RU值为76.483。文章首次利用该项技术创建了水产动物病毒性疫病药物筛选平台，为今后对虾白斑综合征药物的开发提供了理论支撑和科学依据。
Abstract: This article uses surface plasmon resonance technology to establish an anti-white spot syndrome virus drug screening platform targeting VP28 recombinant protein and studies the binding activity of VP28 recombinant protein on 40 Chinese herbal medicines. Results: Among the 40 Chinese herbs, 14 herbs have a significant binding affinity to VP28 recombinant protein and contain active ingredients that bind to VP28 recombinant protein, including Terminalia chebula Retz., Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl, Rheum palmatum L., Cortex Phellodendri chinensis, Biancaea sappan (L.) Tod., Cynanchum otophyllum Schneid., Viola phillipina, Sanguisorba officinalis L., Prunella vulgaris L., Lonicera japonica Thunb., Rosmarinus officinalis L., Clerodendrum cyrtophyllum Turcz., Coptis chinensis Franch., and Scutellaria baicalensis Georgi. Among them, the active ingredients in Terminalia chebula Retz. have the strongest binding force, KD = 1.601 × 10−9, while Coptis chinensis Franch. has the highest content of active ingredients, RU = 76.483. This article is the first to use this technology to create a drug screening platform for viral diseases in aquatic animals, providing theoretical support and a scientific basis for the development of drugs for white spot disease in shrimp in the future.
1. 引言
对虾白斑综合征(White Spot Disease, WSD)是由白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)引起的一种病毒性疫病，具有传染性高、病程短和死亡率高等特点，给对虾养殖业的发展带来极大的危害。世界动物卫生组织(World Organization for Animal Health, WOAH)将其列为必须报备的动物疫病之一，同时也是我国农业部认定的二类动物疫病和对虾苗种产地检疫必检项目。因此，做好对WSD的防控对对虾养殖业的健康发展具有重要意义。
目前针对WSD的药物筛选已经有了部分研究，大部分采用传统的攻毒实验，通过记录死亡率来进行药物筛选，如郭志勋[1]通过给感染WSD的对虾注射中草药液，通过死亡率来判定中草药是否起效，整个实验耗时13天；杨清华[2]通过给感染WSD的对虾投喂混有中草药的饲料，计算死亡率来判定中草药是否有效，实验耗时26天。传统的实验方法耗时长，容错率低，突发事件的发生概率较高，实验成功率偏低，所以急需一种速度快、灵敏度高、准确度高的新方法来进行抗WSD的药物筛选。
作为WSSV囊膜蛋白的一种，VP28是含量最丰富的蛋白结构之一，由204个氨基酸组成，分子量约为22.2 KDa。Yang等[3]和Tsai [4]通过研究表明，VP28在WSSV侵染宿主的过程中起到非常重要的作用。van Huten等[5]在实验中表明，抑制VP28蛋白的同时可以抑制WSSV在虾体内的增殖。因此，VP28蛋白可以作为抗白斑中草药筛选的靶蛋白。
表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)是生物传感分析技术的一种，能够在分子水平上研究中药活性成分与靶点的相互作用关系[6]。该技术具有极高的灵敏度、极强的专一性，同时又能测定结合速率、解离速率等动力学常数和解离平衡常数[7]。这些特点使得该技术在中药活性成分的筛选以及靶点确定方面应用广泛。Liao [8]利用SPR分析技术确定了神经小胶质细胞的抗炎靶点蛋白肌苷-5'-单磷酸脱氢酶2 (IMPDH2)与苏木酮A具有结合力，KD为3.944 nmol∙L−1。郑蓉[9]通过SPR技术证明了新型冠状病毒的主要蛋白酶3CLpro与表没食子儿茶素没食子酸酯具有良好的相互作用，KD为6.17 μmol∙L−1。马荟琳[10]构建了双靶点SPR传感器，应用并证明了新冠病毒的两种关键蛋白S蛋白受体结合域和血管紧张素转换酶2与黄豆苷有良好的结合性。该技术在医药卫生和药物研发领域已经有了较为广泛的应用，但是在动物防疫领域还鲜有应用。
本研究应用表面等离子共振技术，以VP28为目标靶蛋白，建立抗对虾白斑病毒的中药筛选平台，同时对具有抗病毒潜力的40种常见中草药进行筛选，最终筛选出具有抗VP28蛋白活性成分的中草药，为对虾白斑综合征药物的开发提供了理论支撑和科学依据，也为今后渔药的研究开发提供了新的思路。
2. 材料
2.1. 试剂材料
40味中草药，见表1；VP28重组蛋白(委托艾柏森生物科技有限公司进行真核重组表达)；CM5芯片(Cytiva，美国)；50mM NaOH(Cytiva，美国)；pH = 4.0的醋酸钠溶液(Acetate) (Cytiva，美国)；pH = 4.5的醋酸钠溶液(Acetate) (Cytiva，美国)；pH = 2.5的甘氨酸溶液(Glycine-HCl) (Cytiva，美国)；10 × HBS-EP+ Buffer (Cytiva，美国)；EDC溶液(Cytiva，美国)；NHS溶液(Cytiva，美国)；乙醇胺(Ethanolamine) (Cytiva，美国)。
Table 1. 40 Chinese herbal medicines
表1. 40味中草药
名称 |
拉丁名 |
平均分子量(MW) |
黄芪 |
Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge |
525 |
当归 |
Angelica sinensis (Oliv.) Diels |
415 |
黄芩 |
Scutellaria baicalensis Georgi |
385 |
苏木 |
Biancaea sappan (L.) Tod. |
500 |
黄连 |
Coptis chinensis Franch. |
375 |
连翘 |
Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl |
792 |
白芍 |
Cynanchum otophyllum Schneid. |
900 |
诃子 |
Terminalia chebula Retz. |
560 |
大黄 |
Rheum palmatum L. |
895 |
地榆 |
Sanguisorba officinalis L. |
909 |
黄柏 |
Cortex Phellodendri chinensis |
350 |
白果 |
Ginkgo biloba L. |
450 |
金银花 |
Lonicera japonica Thunb. |
750 |
百部 |
Stemona japonica (Blume) Miq. |
315 |
苦参 |
Sophora flavescens Aiton |
705 |
青皮 |
Pericarpium Citri Reticulatae Viride |
370 |
蛇床子 |
Cnidii fructus |
350 |
藿香 |
Agastache rugosa (Fisch. & C. A. Mey.) Kuntze |
400 |
知母 |
Anemarrhena asphodeloides Bunge |
898 |
女贞子 |
Ligustrum lucidum Ait. |
600 |
板蓝根 |
Isatis indigotica Fort. |
350 |
柴胡 |
Radix bupleuri |
505 |
番石榴 |
Psidium guajava L. |
500 |
甘草 |
Glycyrrhiza uralensis Fisch. |
458 |
陈皮 |
Pericarpium Citri Reticulatae |
348 |
龙胆 |
Gentiana scabra Bunge |
495 |
茵陈 |
Artemisia capillaris Thunb. |
350 |
泽泻 |
Alisma plantago-aquatica L. |
385 |
茯苓 |
Indigo naturalis |
330 |
乌梅 |
Prunus mume Siebold & Zucc. |
425 |
山茱萸 |
Cornus officinalis Siebold & Zucc. |
945 |
熟地黄 |
Rehmannia glutinosa (Gaetn.) Libosch. ex Fisch. et Mey. |
465 |
夏枯草 |
Prunella vulgaris L. |
375 |
迷迭香 |
Rosmarinus officinalis L. |
1000 |
栀子 |
Gardenia jasminoides J.Ellis |
535 |
苍耳子 |
Xanthium strumarium L. |
440 |
人参 |
Panax ginseng C. A. Mey. |
698 |
龙葵 |
Solanum nigrum L. |
590 |
紫花地丁 |
Viola phillipina |
250 |
大青叶 |
Clerodendrum cyrtophyllum Turcz. |
710 |
2.2. 仪器设备
Biacore T200分子相互作用分析仪(Cytiva，美国)；高速冷冻离心机(Eppendorf，德国)
3. 方法
3.1. 中草药原液的制备
每味中草药取10 g，投入烧杯加水500 mL，浸泡1 h后煎煮，水沸腾后继续煎煮1 h，两层纱布过滤药渣后浓缩至50 mL，生药浓度为200 mg/mL，离心弃沉淀后取上层药液用1 × HBS-EP+ Buffer稀释至2000 μL/mL，4℃保存备用。
3.2. 药物筛选平台的建立
3.2.1. VP28重组蛋白稀释液最佳pH值的确定
采用Expasy生物学软件(http://www.expasy.org)预测VP28重组蛋白的等电点(pI)和分子量(MW)。用pH值低于该重组蛋白pI值的pH = 4.0和pH = 4.5的醋酸钠溶液，将VP28重组蛋白配置成100 μg/mL的溶液，使其携带正电荷以便与带负电荷的CM5芯片产生静电吸附，用50 mM的NaOH作为再生液，通过Biacore T200的Manual Run的方式进行预耦连。设置进样时间60 s，再生时间30 s，通过结合响应值(RU)的大小确定VP28重组蛋白稀释液的最佳pH值。
3.2.2. VP28重组蛋白的耦联
通过下列公式：
计算出VP28重组蛋白作为配体时的耦连水平理论值(RL)，其中Analyte MW表示中草药的平均分子质量；Ligand MW表示配体的分子质量，即VP28重组蛋白的分子质量；Rmax为芯片最大结合量；Sm为化学计量比。
用确定pH值的醋酸钠溶液将VP28重组蛋白稀释至100 μg/mL作为耦联配体溶液，将EDC溶液与NHS溶液以1:1的比例混合作为CM5芯片的活化试剂，用乙醇胺作为封闭试剂，通过Biacore T200的Manual Run的方法将VP28重组蛋白耦连到CM5芯片上。设置活化时间420 s；多次设置VP28重组蛋白的进样时间，将耦连VP28重组蛋白的响应值耦连到RL以上；设置封闭时间420 s，完成VP28重组蛋白的耦连。
3.3. 中草药筛选
基于上述方法建立VP28重组活性成分中草药的筛选芯片，将制备好的40种中草药原液经0.22 μm的滤膜过滤，用1 × HBS-EP+ Buffer进行梯度稀释作为待测样品，并设置平行组，稀释的生药浓度梯度如表2所示。用1 × HBS-EP+ Buffer作为Startup试剂；用pH为2.5的甘氨酸(Glycine-HCl)作为再生试剂，通过Biacore T200预设的动力学/亲和力分析程序(Kinetics/Affinity)进行每种中草药对VP28重组蛋白的动力学/亲和力实验，设置Startup次数3次；样品进样时间180 s，流速30 μL/min，解离时间300 s；再生时间30 s，流速30 μL/min。通过对亲和力(KD)和响应值(RU)数据的分析，筛选出含有结合VP28活性成分的中草药。
Table 2. Experimental concentration gradient
表2. 实验浓度梯度
组别 |
生药浓度(μg/mL) |
实验组1 |
2000 |
实验组2 |
1000 |
实验组3 |
500 |
实验组4 |
250 |
实验组5 |
125 |
实验组6 |
62.5 |
实验组7 |
31.25 |
实验组8 |
15.625 |
实验组9 |
7.8125 |
实验组10 |
0 |
平行组 |
250 |
4. 结果与分析
4.1. 药物筛选平台的建立
4.1.1. VP28重组蛋白稀释液的最佳pH值
预测的VP28重组蛋白的等电点(pI)及分子量(MW)，见表3。
Table 3. pI and MW of VP28 recombinant protein
表3. VP28重组蛋白的pI和MW
名称 |
pI |
MW (KDa) |
VP28 |
4.69 |
22.2 |
用pH = 4.0和pH = 4.5的醋酸钠溶液分别将VP28重组蛋白稀释至100 μg/mL，预耦连的结果如图1所示，预耦连的数据见表4。pH为4.0的醋酸钠溶液结合的响应值为231.8RU，pH为4.5的醋酸钠溶液结合的RU值为544.1RU。通过数据分析认为，在相同实验条件下，pH为4.5醋酸钠溶液稀释的VP28重组蛋白预耦连效果最好，结合的响应值最高。因此，最佳VP28重组蛋白的醋酸钠稀释液pH值为4.5。
Figure 1. Pre coupling results of sodium acetate solutions with different pH values as diluents. A: Coupling results of sodium acetate solution with pH = 4.0; B: Coupling results of sodium acetate solution with pH = 4.5
图1. 不同pH值醋酸钠溶液作为稀释液的预耦连结果。A：pH = 4.0的醋酸钠溶液耦连结果；B：pH = 4.5的醋酸钠溶液耦连结果
Table 4. Pre coupled RU values of sodium acetate solutions with different pH values as diluents
表4. 不同pH值醋酸钠溶液作为稀释液的预耦连RU值
pH |
进样时间(s) |
Baseline (RU) |
Stability (RU) |
响应值(RU) |
4.0 |
60 |
0.0 |
231.8 |
231.8 |
4.5 |
60 |
3.8 |
547.9 |
544.1 |
4.1.2. VP28重组蛋白的耦连结果
1) VP28重组蛋白RL值的计算
根据2.2.2.1所述的公式，计算RL值，其中Rmax为CM5芯片的最大结合量，即Rmax = 50；Analyte MW为分析物的分子量，本实验中的分析物中药液是混合物，Analyte为未知，选用经验值1000；Ligand MW为配体的分子量，本实验中的配体为VP28重组蛋白，分子量22.2 KDa；Sm为化学计量比，Analyte：Ligand未知时，选择Sm = 1。通过公式计算出VP28重组蛋白在CM5芯片上的RL值为1110 RU。
2) VP28重组蛋白的耦连结果
耦连结果如图2所示，耦连数据见表5。经过5次耦连后，VP28蛋白在CM5芯片上的耦连响应值为1887 RU，高于RL，实验符合预期，用于药物筛选的VP28重组蛋白与芯片偶联完成。
Figure 2. VP28 protein coupled to CM5 chip results. A: First coupling; B: Second coupling; C: Third coupling; D: Fourth coupling
图2. VP28蛋白耦连至CM5芯片结果。A：第一次耦连；B：第二次耦连；C：第三次耦连；D：第四次耦连
Table 5. RU values of VP28 protein coupled to CM5 chip
表5. VP28蛋白耦连至CM5芯片的RU值
次数 |
进样时间(s) |
Baseline (RU) |
Stability (RU) |
响应值(RU) |
第一次 |
40 |
−12.1 |
428.5 |
440.6 |
第二次 |
50 |
396.4 |
684.4 |
288 |
第三次 |
80 |
610.3 |
1567.8 |
957.5 |
第四次 |
40 |
1357.8 |
1558.7 |
200.9 |
4.2. 40味中草药的筛选结果
基于偶联完成的VP28重组蛋白芯片对40味中草药进行筛选，筛选发现诃子、连翘、大黄等14味中草药对VP28重组蛋白有结合力，见表6，可证明其含有抗VP28重组蛋白的活性成分。其余26味药材均无法计算出KD值，说明对VP28重组蛋白没有结合力，不含有抗VP28重组蛋白的活性成分。在14味有效中草药中，诃子的KD值为1.610 × 10−9，KD值最小，结合力最强，但响应值仅为11.305 RU，有效成分的含量偏低；其次是连翘，KD值为1.070 × 10−5，响应值为2.796 RU，有效成分含量最低；大青叶、黄连和黄芩的KD值最小，分别为4.204 × 10−3、4.663 × 10−3、4.933 × 10−3，所含有的活性成分结合力最弱，但是黄连的响应值为76.483 RU，有效成分含量最高。
Table 6. KD and RU values of 14 Chinese herbal medicines binding to VP28 recombinant protein
表6. 14味中草药与VP28重组蛋白结合的KD值及RU值
中草药 |
KD |
响应值(RU) |
诃子 |
1.601 × 10−9 |
11.305 |
连翘 |
1.070 × 10−5 |
2.796 |
大黄 |
1.430 × 10−4 |
3.994 |
黄柏 |
2.290 × 10−4 |
4.276 |
苏木 |
5.670 × 10−4 |
4.426 |
白芍 |
6.050 × 10−4 |
6.475 |
紫花地丁 |
6.440 × 10−4 |
45.042 |
地榆 |
7.660 × 10−4 |
38.05 |
夏枯草 |
9.710 × 10−4 |
14.057 |
金银花 |
2.720 × 10−3 |
8.574 |
迷迭香 |
2.900 × 10−3 |
11.552 |
大青叶 |
4.204 × 10−3 |
10.987 |
黄连 |
4.663 × 10−3 |
76.483 |
黄芩 |
4.933 × 10−3 |
19.284 |
5. 讨论
中草药是一种纯天然并且无任何污染的优质良药，大部分取自植物，材料易获取、成本低廉、资源广泛。渔用中草药最终回归自然，在动物体内无残留，对环境没有污染影响，可谓是绿色药物，这与抗生素及化学药品有着本质的区别，进而在生产中避免了耐药性和抗生素等问题[11]。中草药的抗病毒方式主要有两种：一是直接杀灭病毒，或者阻断病毒对正常细胞的吸附、穿入、复制等环节，从而起到抗病毒的作用；二是通过诱发机体产生干扰素或提高机体的非特异性免疫水平以达到抑制病毒感染的目的[12]。本研究主要针对中草药阻断病毒感染方面进行研究。
本实验研究了40味中草药对VP28蛋白的结合活性，诃子、连翘、大黄、黄柏、苏木、白芍、紫花地丁、地榆、夏枯草、金银花、迷迭香、大青叶、黄连、黄芩等14味中草药具有明显的结合力，说明筛选出的14味中草药均含有能够结合VP28蛋白的活性成分，能够抑制或阻断VP28蛋白在对虾白斑病毒感染对虾的过程中发挥作用。14味中草药中，黄连含有的有效成分含量最高，但是其含有的有效成分结合VP28蛋白的能力却不高，黄连为清热类药物，味苦、性寒，具有清热燥湿、泻火解毒等功效，陈辉辉[13]在研究中发现，给感染白斑综合征病毒的对虾投喂含黄连的复方中草药，能够显著提高对虾的存活率，说明黄连的有效成分结合VP28蛋白的能力不强，但是其含量升高后，量变产生质变，发挥了抗白斑的作用。诃子的有效成分含量偏低，但在实验中对VP28蛋白的结合力最强，具有明显阻断VP28蛋白的作用，即含量低也能发挥相应作用，诃子是藏医中常用的药物，被称为“藏药之王”[14]，具有抗病毒、抗氧化等多方面的药理作用[15]。大黄、黄柏、黄芩为水产上比较常用的药物，具有抗炎、抗病毒等作用，田海军等[16]应用大黄和黄芩的复方中草药投喂克氏原螯虾，能够显著提高克氏原螯虾抗白斑综合征病毒感染的能力。
6. 结论
本文首次将表面离子共振技术应用到水生动物疫病防控中，建立了一种新的以VP28蛋白为靶点的抗白斑综合征病毒药物筛选平台，并对40味中草药进行了针对VP28蛋白结合活性的研究。筛选出了14种含有结合VP28蛋白活性成分的中草药，该方法具有筛选速度快，针对性强等优势，为今后水产养殖领域新药和饲料添加剂的开发提供了新思路和新方向。
基金项目
南美白对虾绿色健康养殖技术的推广和应用(项目编号：GBGG202301)；基于对虾白斑综合征VP28囊膜蛋白的中药防治药物的筛选(项目编号：YK202403)。
NOTES
*通讯作者。