基于网络药理学探讨温胆汤对痰浊中阻型后循环缺血性眩晕的作用机制

The Mechanism of Warm Bile Soup on Circulating Ischemic Vertigo Was Investigated Based on Network Pharmacology

摘要: 本研究旨在利用网络药理学方法预测温胆汤在治疗痰浊中阻型PCIV的潜在作用机制。利用多个数据库、分析平台及文献检索，收集出温胆汤中各中药成分靶点与疾病靶点，取其共同交集靶点，并进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)的富集分析，同时使用相关软件分别构建出成分–疾病–通路靶点网络和蛋白质–蛋白质相互作用网络图。经分析筛选后，在温胆汤中发现49种活性化合物，其中与PCIV相关的共139个靶点。药物主要成分包括柚皮苷、槲皮素、木犀草素、黄芩苷，关键核心靶点包括IL6、TNF、STAT3等。KEGG信号通路包括癌症的途径、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌作用–受体激活、IL-17信号等。结论：温胆汤对PCIV的治疗作用可能是通过柚皮苷、黄芩苷等成分及调节IL6、TNF等靶点从而参与抗炎、促进脂质代谢等多条途径。

Abstract: This study aimed to predict the potential mechanism of warm bile soup in the treatment of sputum resistant PCIV. Using multiple databases, analysis platform and literature retrieval, collect the Chinese medicine composition targets and disease targets, take the common intersection targets, and gene ontology (GO) and Kyoto gene and genome encyclopedia (KEGG) enrichment analysis, at the same time using the related software to build components-disease-pathway target network and protein-protein interaction network diagram. After analytical screening, 49 active compounds were found in bile soup, including a total of 139 targets associated with PCIV. The main components of the drugs include naringin, quercetin, luteolin, and baicalin, and the key core targets include IL 6, TNF, and STAT 3. KEGG signaling pathways including cancer pathway, lipids and atherosclerosis, chemical carcinogenesis-receptor activation, IL-17 signaling, etc. Conclusion: The therapeutic effect of bile soup on PCIV may be through naringin, baicalin and other components and targets such as IL 6 and TNF to participate in anti-inflammation and promote lipid metabolism.

1. 引言

温胆汤是中医经典祛痰名方之一，起自《集验方》，其组成精简，由半夏、陈皮、竹茹、枳实、茯苓、甘草构成，全方主治中焦痰湿，胆郁痰扰、头眩心悸等，祛痰健脾化湿，升清阳，降浊阴，畅气机而止眩晕。温胆汤在现代临床研究运用中，对于脑血管疾病和神经病变方面具有多种治疗机制，如抗氧化应激、促进神经细胞再生、调节神经递质水平，修复缺血性脑损伤、改善学习记忆障碍等[1]。

2. 材料和方法

2.1. 温胆汤药物成分的筛选及靶点的收集

借助中药系统药理学数据库与分析平台[2] (TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/disease.php?qd=421)检索半夏、陈皮、茯苓、枳实、茯苓等中药的主要活性成分，设定口服生物利用度 ≥ 30% (OB)和类药性 ≥ 18% (DL)，同时找到这些成分对应的靶点蛋白。对于在TCMSP无法搜索到的竹茹，通过本草组鉴综合数据库(HERB) (http://herb.ac.cn/Detail/?v=HERB007116&label=Herb)搜索其有效活性成分，在PUBCHEM数据库[3]中检索出相应的借助SMILES号和化学结构式，导入SwissTargetPrediction数据库[4]中预测其靶点，以“problility > 0”为条件，筛选出相对应的蛋白质靶点。最后统一在Uniprot蛋白质数据库[5] (https://www.uniprot.org)中进行名称转换规范，设定条件为生物物种为“HUMAN”，数据类型为“REVIEWED”。

2.2. 后循环缺血性眩晕靶点收集与韦恩图的构建

在GeneCards疾病数据库[6] (https://www.genecards.org/)中以“posterior circulation is chemic vertigo”为关键词搜索，筛选条件设为中位数，得到PCIV相关的靶点基因，再与药物成分靶点取交集后通过DrawVennDiagram在线分析绘制韦恩图。

2.3. 药物–疾病PPI网络的构建

将交集数据录入String平台数据库[7] (https://string-db.org/)构建蛋白质相互作用(PPI)网络图，物种选为“HomoSnpiens”，最小的作用阈值选为“highestconfidence”(>0.7)，消除游离蛋白，得出其图表；再在Cytoscape 3.10.1上用degree值分析以获取核心作用点，并通过筛选得出总网络中前10个关联性最强的靶点。

2.4. KEGG与GO富集分析

运用Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)，将核心预测靶点导入平台中，分别获取了基因本体(Gene Ontology, GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路，分析筛选后，各取前20个主要的信号通路，并根据其结果输入“微生信”平台绘制相应柱状图和气泡图。

2.5. “成分疾病靶点”关系网络构建

利用Cytoscape 3.10.1软件整合中药成分，疾病作用靶点，构建出温胆汤治疗PCIV的网络图。

3. 结果

3.1. 温胆汤预测靶点的收集

初步获得温胆汤的活性成分共150种，其中半夏13种、陈皮5种、竹茹3种、甘草92种、茯苓15种、枳实22种。筛选后得到49个活性化合物，通过活性化合物以确定蛋白质靶点，去重校正后得到264个预测靶点。

3.2. PCIV相关靶点检索

在GeneCards数据库中搜索结果显示有2408个PCIV相关靶点，筛选出relevance score > 6.505 (中位数)的有1204个。

3.3. 温胆汤与PCIV共同靶点预测及“成分–疾病–靶点”关系网络构建

利用Draw Venn Diagram在线工具进行分析，结果显示药物与疾病有139个共同靶点，并通过绘制韦恩图(图1)进行展示。利用Cytoscape 3.10.1平台绘制出成分–疾病–靶点图(见图2)，总共包含315个节点(其中有139个预测靶点，49个成分)和552条边。

3.4. PPI网络的构建

在String平台提交139个共同靶点，清除游离靶点，得到PPI网络中135个蛋白节点和2666条边(见图3)。边表示蛋白间关联，关联越大，线越密。

3.5. GO和KEGG富集通路分析结果

根据Metascape数据库中对139个靶点的GO富集研究，得到了所包含的生物过程，包括对外来生物刺激的反应、细胞对脂质的反应、对细胞运动性的积极调节、细胞对氮化合物的反应等(见图4)。经“微生信”平台对KEGG通路分析得出的气泡图中(见图5)，可以发现阈值最高点分布在癌症的途径、脂质和动脉粥样硬化、化学致癌作用–受体激活、IL-17信号通路等前5条信号通路。根据PCIV的发病机制，可排除与癌症相关通路后，推测关键靶点基因主要集中于脂质和动脉粥样硬化的通路中，可进行下一步的深入分析。

Figure 1. Drug and Disease Wayn diagram

图1. 药物与疾病韦恩图

Figure 2. Component-disease-target map

图2. 成分–疾病–靶点图

Figure 3. A PPI network diagram of the interaction between warm gallbladder soup and PCIV

图3. 温胆汤与PCIV互作PPI网络图

Figure 4. GO enrichment pathway analysis plots

图4. GO富集通路分析图

Figure 5. KEGG enriched pathway bubbles

图5. KEGG富集通路气泡图

4. 讨论

后循环缺血性眩晕(posterior circulation ischemic vertigo，简称PCIV)是以后循环为主的动脉血管出现短暂性缺血的疾病，病情严重可进展为脑卒中，危害患者生命[8]。病发主要由动脉粥样硬化引起，发病过程涉及动脉血管栓塞。PCIV常以眩晕为临床首发症状，约占60%，年龄越大，患病率越高，中老年人多见，病程绵长，难根治且易复发[9]。针对脑缺血、改善眩晕，现在临床上大多采用氟桂利嗪、倍他司汀、罂粟碱、甲钴胺等扩张血管、改善微循环、营养神经的药物治疗，但疗效欠佳[10]，很多病人由于症状反复发作且持续不缓解转而尝试中医治疗[11]。中医病症里“中风”“眩晕”包含PCIV相关的临床表现，PCIV与痰浊相关的证型包括痰浊中阻、风痰上扰、痰浊上蒙、血瘀痰阻等，其主要病机多是由于饮食不节，情志不畅，损伤脾胃，中焦运化无权，导致痰湿蕴生，上蒙清窍，发为眩晕。“痰浊”在现代西医学中可引申为炎症、水肿、血脂、胆固醇等内涵，且根据现代病理生理学研究，皆表明“痰”的生成与脂质代谢密不可分[12] [13]，而脂质代谢的异常同样也是引起眩晕的重要影响因素。因此在构建成分疾病通路靶点图上，对在脂质与动脉粥样硬化通路中起重要调控作用的活性成分进行探讨。

由Cytoscape 3.10.1软件中degree值大小推论温胆汤中主要成分有柚皮苷、槲皮素、木犀草素、黄芩苷，皆是黄酮类化合物。柚皮苷是在柑橘类植物的果皮中含量最高的一种类黄酮糖苷，例如陈皮、青皮、枳壳和枳实。它具有多种作用，如降脂、抗血栓、抗凝[14]、清除自由基、抗氧化、保护神经系统[15]。槲皮素不仅具有抗氧化和抗炎特性，同时已验证其神经保护效果，并显现心脑血管系统的保护疗效。经CAO等人研究[16]，发现槲皮素能够通过上调RAW264.7类哺乳动物Ste20样激酶1 (MST1)调控细胞自噬，来抑制动脉粥样硬化。木犀草素降脂作用较强，不仅能够通过降低脂质的合成与积累改善脂质代谢，也可通过加快脂肪的分解和褐变及促进胆固醇的转化与排出调节脂质代谢紊乱[17]。孙霁寒等[18]研究发现通过木犀草素能显著改善大鼠血脂，调节脂代谢，降低脂质过氧化，使抗氧化酶活性提高，增强细胞抗氧化功能。黄芩苷具有较强的抗氧化能力，能够通过清除体内氧自由基、抑制脂质过氧化反应来保护受损脑细胞[19]，研究结果[20]显示黄芩苷对缺血性脑损伤的大鼠具有神经保护作用。因此柚皮苷、槲皮素、木犀草素、黄芩苷这些活性成分在脂质与动脉粥样硬化通路上都有起到调脂、抗氧化、保护神经的作用。

通过PPI网络图得到IL6、TNF、STAT3、IL1B、等关键AKT1靶点。IL-6是一种多功能细胞因子，可促进免疫[21]、组织再生和新陈代谢，当作用于多种组织和细胞系时，一方面促进细胞生长和分化，另一方面促进生长停滞；作为间接血管生成因子，据研究[22]结果表明，缺氧诱导IL-6可能会促进VEGF的表达，最终导致血管生成；作为“反式信号传导”在中枢神经系统中可以通过相似性调节能量和葡萄糖稳态。此外，IL-6在中枢神经系统中大量表达，尤其是下丘脑区域，可以调节食欲和能量消耗。Stenlöf [23] [24]等人通过实验研究，在大鼠脑室内输注IL-6后观察，发现大鼠体脂体积减少，得出IL-6与中枢神经系统调控脂质代谢相关。另一实验证明，转基因小鼠大脑中IL-6的过度表达会触发血脑屏障分解、神经胶质激活和神经元损伤的发生，推动中枢神经系统疾病的发展[25]。与此同时，白细胞介素6还能作为介质改善神经血管功能障碍、抑制神经退行性变、减少神经炎症[26]。

肿瘤坏死因子(TNF)主要来源于巨噬细胞和激活的T细胞，可显著调节局部和全身炎症反应，当作为促炎细胞因子可影响细胞内脂质代谢。动脉粥样硬化斑块的形成始于单核细胞浸润到血管壁的内膜层，然后分化为巨噬细胞和巨噬细胞摄取修饰的脂蛋白，导致细胞内脂质的积累，当脂质累积到整个细胞时则变为巨噬细胞泡沫细胞，这是动脉粥样硬化斑块的关键特征。Persson等人[27]通过摄取聚集的低密度脂蛋白(AgLDL)或极低密度脂蛋白(VLDL)来加载分化的原代人巨噬细胞或THP-1细胞，然后与IL-1β (0-5000pg / ml)在无脂蛋白培养基中孵育24小时，添加外源性IL-1β后，导致细胞内胆固醇和甘油三酯的剂量依赖性保留，将IL-1β与TNF-α交换给出了类似的反应，加上脂肪酸外排和细胞内脂肪酸活化的分析揭示了TNF的刺激会使细胞中脂质利用率降低。因此，可以推理出TNF-α可通过促进细胞内脂质的积累来加快巨噬细胞泡沫细胞的形成，如果存在于体内，这些机制将进一步增强这种细胞因子的促动脉粥样硬化特性。

STAT3作为一种重要的核转录因子，在脂质与动脉粥样硬化信号通路上起到一定程度的调控作用[28]，在动脉粥样硬化过程中参与内皮功能障碍、脂质代谢、巨噬细胞极化、炎症调节、血管平滑肌增殖与迁移[29]。STAT3抑制剂可抑制ox-LDL诱导的巨噬细胞脂质积累，减轻巨噬细胞炎症反应[30]。在体内和体外实验中，抑制JAK2/STAT3 通路可降低巨噬细胞内三酰甘油、TC和低密度脂蛋白胆固醇水平[31]，抑制血管平滑肌细胞增殖，减轻颈动脉内膜厚度[32]；并且通过抑制STAT3可以使内皮细胞的增殖和迁移停滞，抑制血管生成，延缓不稳定斑块的形成[33]。

综上所述，本文初步探索了温胆汤在治疗痰浊中阻型后循环缺血性眩晕方面的作用机制，借助网络药理学，发现温胆汤中多种有效成分可能作用于多个靶点，如IL6、TNF、STAT3、IL1B、IL10等，进而调控以脂质和动脉粥样硬化为主的多条通路发挥其治疗PCIV的作用，为进一步探讨温胆汤的治疗作用提供了理论依据。

NOTES

^*第一作者兼通讯作者。