Alisol A通过抑制Hippo信号通路抑制鼻咽癌细胞

Alisol A Inhibited Nasopharyngeal Carcinoma Cells by Inhibiting the Hippo Signaling Pathway

摘要: 背景：鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一种源于鼻咽上皮的恶性肿瘤。Alisol A是一种来源于泽泻根茎的三萜类化合物，具有抑制癌细胞生长和诱导癌细胞凋亡的能力。Alisol A对鼻咽癌的影响尚不明确。方法：Western blot检测蛋白表达。采用AutoDock Vina和Discovery Studio软件进行分子对接。结果：Alisol A可抑制鼻咽癌细胞的活力、增殖、迁移和侵袭。分子对接模拟实验证实Alisol A与YAP蛋白结合。此外，在鼻咽癌细胞中，Alisol A促进YAP的磷酸化并抑制YAP的表达。结论：Alisol A通过抑制Hippo信号通路抑制鼻咽癌细胞。Alisol A可能是治疗鼻咽癌的候选药物。

Abstract: Background: Nasopharyngeal carcinoma (NPC) is a malignant tumor originating from the nasopharyngeal epithelium. Alisol A, a triterpenoid compound derived from rhizome of Alismatis alismatis, has been shown to inhibit cancer cell growth and induce apoptosis. The effect of Alisol A on nasopharyngeal carcinoma (NPC) is still unclear. Methods: Western blot was used to detect protein expression. AutoDock Vina and Discovery Studio software were used for molecular docking. Results: Alisol A inhibited the viability, proliferation, migration, and invasion of NPC cells. The molecular docking simulation assay confirmed that Alisol A is bound to YAP protein. In addition, Alisol A promoted the phosphorylation of YAP and suppressed the expression of YAP in NPC cells. Conclusion: Alisol A inhibits the growth of NPC cells by inhibiting Hippo signaling pathway. Alisol A may be a candidate drug for the treatment of NPC.

1. 引言

鼻咽癌(NPC)是一种恶性程度较高的头颈部肿瘤，其特征为高度侵袭性和易于发生远处转移，特别在东南亚地区的发病率较高[1] [2]。NPC的治疗通常依赖于放射治疗和化疗，尽管近年来治疗手段不断进步，但由于其侵袭性强、转移潜力高及化疗耐药性问题，患者预后不尽理想，鼻咽癌的治疗效果仍然受到癌细胞耐药性和复发率高等因素的限制[3]。因此，探索新型有效的治疗策略成为了亟待解决的课题。随着分子靶向治疗的发展，探索新的分子靶点及靶向药物成为改善NPC治疗效果的关键方向之一。

近年来，Hippo信号通路在多种肿瘤发生与发展中的作用受到广泛关注，其在维持细胞增殖、凋亡和迁移的平衡方面具有重要作用[4]。在胃癌[5]、非小细胞肺癌[6]、乳腺癌[7]等多种癌症中，Hippo通路的失调往往会导致细胞的无限增殖和转移能力增强[8]。Alisol A作为一种从泽泻(Alisma orientale)提取的三萜类化合物，其在抑制多种癌细胞生长方面展现出潜力[9]。近年来的研究发现，Alisol A可以通过多种信号通路发挥抑癌作用[10]，包括抑制PI3K/Akt、Wnt/β-catenin等信号通路。然而，Alisol A在鼻咽癌中的作用机制尚未得到充分研究，特别是其是否通过调节Hippo信号通路抑制NPC细胞的增殖和迁移仍然不明。针对这一研究空白，本研究拟探索Alisol A在鼻咽癌细胞中的作用及其潜在的分子机制，尤其关注其对Hippo信号通路的影响。

本文使用AutoDock Vina和Discovery Studio等分子对接软件，预测Alisol A与Hippo信号通路相关蛋白的结合模式。分子对接技术是一种重要的计算机辅助药物设计方法，通过模拟小分子与靶蛋白的结合位点和结合方式，可以有效预测其生物活性，为实验验证提供理论基础[11]。分子对接的结果不仅有助于理解Alisol A的作用位点，还可为进一步的实验设计提供依据。此外，实验部分将采用Western blot印迹法检测Alisol A处理后鼻咽癌细胞中关键蛋白的表达变化。Western blot是一种经典的蛋白表达分析方法[12]，通过检测特定蛋白的表达水平和磷酸化状态，可以直接观察Alisol A对Hippo信号通路的影响。在本研究中，通过Western blot分析Alisol A对YAP及其磷酸化水平的调控情况，有望揭示其抑制Hippo通路的作用机制。

2. 材料和方法

2.1. 细胞培养

鼻咽癌细胞株(C666-1和HK1)购自上海汇英生物技术有限公司(中国上海)。将细胞置于含有10% FBS、100 U/mL青霉素G和100 μg/mL链霉素(HyClone, Logan, UT, USA)的RPMI-1640中，37℃，5% CO₂培养箱中培养。Alisol A购自Taotu生物技术有限公司(中国上海)，溶于二甲基亚砜(DMSO)中。

2.2. 免疫印迹

用裂解缓冲液在冰上裂解总细胞。采用核蛋白提取试剂盒(Beyotime Biotechnology, Jiangsu, China)提取并分离细胞核蛋白和细胞质蛋白。然后，用SDS-PAGE分离20 μg蛋白，转移到PVDF膜(Millipore, Billerica, MA, USA)上。将膜与特异性抗体孵育。一抗如下：β-actin (1:20 0.4967), GAPDH (1:20 0.5174), Histone H3 (1:20 0.9715)，YAP (1:20 0.4912)，p-YAP (ser127) (1:20 0.4911)，MMP2 (1:20 0.4022)，MMP9 (1:20 0.3852)，cyclin D1 (1:20 0.2922)，cyclin E1 (1:20 0.20808)，CDK2 (1:20 0.2546)，CDK4 (1:20 0.12790) (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA)。将膜与二抗(1:500, A0545) (Sigma, St. Louis, MO, USA)孵育。最后，使用增强化学发光检测试剂盒(Cell Signaling Technology)对蛋白条带进行可视化，并使用GE Amersham Imager 600成像系统进行拍照。

2.2.1. 免疫荧光

将固定的细胞用YAP (1:30 00, 14729) (细胞信号技术)孵育。用DAPI孵育细胞，用共聚焦显微镜(Leica，Wetzlar，德国)观察细胞。

2.2.2. 分子对接

YAP的晶体结构从蛋白质数据库(PDB, http://www.rcsb.org/, ID: 4rex)获得。每个蛋白质的晶体结构是根据最佳分辨率选择的。利用PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得Alisol A (MOL000850)的三维结构。采用AutoDock Vina和Discovery Studio软件进行对接模拟和计算。使用PyMOL计算均方根偏差(RMSD)值。绑定模式预测选择RMSD < 2.0 Å。

2.3. 统计分析

所有分析使用SPSS 22.0程序(IBM Corp., Armonk, NY, USA)进行。以p < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

Alisol A减弱YAP在鼻咽癌细胞中的核表达

AutoDock Vina软件检测Alisol A与YAP的对接作用(图1(A))。粉色代表氨基酸分解，黄色虚线代表氢键，淡绿色代表分子的优先确认(RMSD = 0.180 Å，Bond energy = −6.7 Kcal/mol)。使用Discovery Studio软件预测Alisol A与YAP的相互作用，二维原理图如图1(B)所示。我们进一步研究了Alisol A对Hippo信号通路的影响。Alisol A处理后YAP蛋白表达降低，p-YAP Ser127水平升高(图1(C))。Alisol A减少了细胞核中的YAP，而增加了细胞质中的p-YAP Ser127 (图1(D))。

4. 讨论

鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)是一种来源于鼻咽黏膜上皮的恶性肿瘤，主要发生在鼻咽顶壁及咽隐窝区域[13]。鼻咽癌具有高度侵袭性和转移性，对患者的健康和生活质量构成严重威胁。鼻咽癌在早期阶段就容易通过淋巴系统向颈部淋巴结转移，导致颈部淋巴结肿大。转移后的淋巴结增大可能压迫周围组织，引起疼痛或吞咽困难。颈部淋巴结的转移还增加了肿瘤向远处转移的风险，使得癌症的治疗更加复杂[14]。鼻咽癌还易发生远处转移，常见的转移部位包括肺、骨、肝等器官。远处转移后，患者会出现一系列严重的并发症。远处转移意味着癌症已进入晚期，治疗难度和治疗费用显著增加，且预后往往较差[15]。

(A) AutoDock Vina软件检测Alisol A与YAP的对接作用；(B) Discovery Studio软件检测Alisol A与YAP的对接作用。(C) Western blot检测Hippo信号通路相关蛋白的表达。(D) Western blot检测细胞质或细胞核中YAP的表达。(E)免疫荧光检测细胞核中YAP的表达。比例尺，10 µm。数据以三个独立实验的平均值 ± SD表示(与对照组相比，^*p < 0.05，^**p < 0.01，^***p < 0.001)。NPC：即鼻咽癌。

Figure 1. Alisol A attenuates YAP nuclear expression in NPC cells

图1. Alisol A减弱YAP在鼻咽癌细胞中的核表达

Alisol A是一种从泽泻(Alisma orientale)中提取的天然三萜类化合物，具有多种生物活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化等[16]。近年来的研究表明，Alisol A能够影响多个信号通路，如MAPK、PI3K/Akt和Wnt信号通路，在多种癌症类型中表现出抗肿瘤活性。Alisol A的抗肿瘤机制包括诱导癌细胞凋亡、抑制细胞增殖、抑制迁移和侵袭等[17]。Alisol A作为一种天然化合物，不仅安全性相对较高，而且具有较强的靶向性。

Hippo信号通路在细胞增殖、凋亡、组织大小控制和再生过程中起重要作用，主要通过调控YAP/TAZ转录因子活性来影响基因表达[18]。Hippo通路的核心成分包括MST1/2激酶和LATS1/2激酶，通路的激活会导致YAP/TAZ的磷酸化，使其滞留在细胞质中，从而抑制其核内活性[19]。YAP/TAZ的过度活化被认为与癌症的发生和发展密切相关[20]。

在本研究中，AutoDock Vina和Discovery Studio软件用于模拟Alisol A与YAP等蛋白的结合情况，以评估其对Hippo信号通路的调控潜力。Hippo信号通路在抗癌治疗中起主要作用[21]。YAP是Hippo信号通路的主要成员和下游效应分子[22]。分子对接用于鉴定化合物的潜在蛋白靶点[23]。基于分子对接分析，我们发现Alisol A是一个有效的YAP抑制剂。YAP在不同类型的癌症中被确定为一种癌基因[24] [25]。有研究表明，YAP诱导的细胞增殖促进是由其核转位决定的[26]。Hippo通路正常状态时，上游激酶(MST1/2和LATS1/2)活跃时，通过磷酸化YAP (尤其是Ser127位点)，使YAP与细胞质锚定蛋白14-3-3结合，从而将YAP留在细胞质中并抑制其核转位。细胞质中的YAP无法激活下游的转录程序，导致增殖信号被抑制。Hippo通路的失活(例如MST1/2或LATS1/2的突变或功能缺失)导致YAP去磷酸化。去磷酸化的YAP解离14-3-3锚定蛋白，进入细胞核，与转录因子(主要是TEAD家族蛋白)结合，启动增殖相关基因的表达。细胞外基质的刚性可通过促进F-actin聚合来抑制Hippo通路，从而增强YAP的核转位。汉黄芩苷治疗子宫内膜癌后YAP表达降低[27]。在肝细胞癌中，克罗索酸通过将YAP从细胞核中转运来诱导对癌症进展的抑制[28]。然而，在肝癌细胞的全细胞提取物中，青蒿素处理后YAP蛋白表达没有变化[29]。

本研究显示在鼻咽癌细胞中，Alisol A能够通过抑制Hippo信号通路来发挥抗癌效果。具体而言，Alisol A处理后，观察到YAP的表达水平下降，且核内活性降低，提示其促进了YAP的磷酸化和细胞质滞留。此外，Alisol A还可以通过上调MST1/2和LATS1/2的活性来激活Hippo通路，从而增强对YAP的抑制作用。通过这一机制，Alisol A能够降低YAP/TAZ依赖的基因表达水平，从而抑制鼻咽癌细胞的增殖和侵袭。

5. 结论

综上所述，Alisol A通过抑制Hippo信号通路而抑制鼻咽癌细胞，表明其在鼻咽癌治疗中的潜力，为治疗鼻咽癌提供了新的机制。未来的研究应进一步明确其作用机制，评估其与其他治疗方式的联合效果，并优化其给药方式，以期更好地应用于临床鼻咽癌治疗中。

数据和材料的可用性

本研究中使用和分析的数据集可根据合理要求从通信作者处获取。

NOTES

^*通讯作者。