1. 引言
水产养殖中，微生物群落是养殖生态系统的重要组成部分，在维持生态系统稳定性和保障养殖效益方面发挥作用[1] [2]。中华绒螯蟹是中国水产养殖的重要经济产品，其养殖产量、品质的波动对水产养殖产业会带来不可估量的影响[3] [4]。目前微生物群落结构和多样性是微生物生态学和环境科学研究的热点内容对目标环境微生物群落的种群结构和多样性进行分析并研究其动态变化，可以为优化群落结构提供有效的方法[5] [6]。为探究箱塘联动生态养殖模式下池塘底泥细菌群落结构特征及季节变动，并比较与传统河蟹单养模式群落结构差异。本研究通过利用16S rRNA基因高通量测序技术，比较河蟹单养和鲈鱼套养模式下池塘底泥微生物多样性差异，分析不同养殖模式下环境微生物的变化差异，在实际养殖中及时通过人工调控提高有益菌优势地位，保持水质健康，以期为中华绒螯蟹养殖模式探索提供理论基础，实现绿色环保的生态养殖模式。
2. 材料方法
2.1. 试验池塘及网箱设置
选取加州鲈 + 河蟹箱塘联动养殖模式14号塘，以河蟹单养模式7号塘作为实验比较组，采样时间设置在3月、4月、5月、7月、8月、11月，即河蟹养殖周期的前、中、后期。分别利用抓斗式采泥器在池塘对角线两侧离岸1.5 m及池塘中心位置采集底泥样品，将样品分别置于无菌样品袋中。底泥样品放于−80℃冰箱保存备用。在整个研究过程中，共收集了12个池塘底泥样本，样品编号为7_Mar、7_Apr、7_May、7_Jul、7_Aug、7_Nov、14_Mar、14_Apr、14_May、14_Jul、14_Aug、14_Nov。
2.2. 底泥样品DNA提取、扩增和测序
使用Fast DNA® SPIN Kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals, U.S.)提取养殖底泥样品中微生物群落基因组DNA，具体步骤参考说明书。采用1.5%琼脂糖凝胶检测其DNA的完整性，采用NanoDrop1000紫外可见分光光度计检测其DNA的浓度和纯度。16S rRNA基因V3-V4区扩增引物为：F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。然后使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒(Illumina)进行文库构建，构建好的文库采用Illumina平台(派森诺，上海)对群落DNA片段进行双端(Paired-end)测序。
2.3. 数据处理与分析
2.3.1. 序列处理
通过质量初筛的原始序列按照index和Barcode信息，进行文库和样本划分，并去除barcode序列。按照QIIME2 dada2分析流程或Vsearch软件的分析流程进行序列去噪或OTU聚类。根据ASV/OTU在不同样本中的分布，评估每个样本的Alpha多样性水平，并通过稀疏曲线反映测序深度是否合适。在物种分类学组成层面，通过各种非监督、监督的排序、聚类和建模手段，结合相应统计学检验方法，进一步衡量不同样本(组)间的物种丰度组成差异，并尝试寻找标志物种。
基于上海派森诺基因云平台(https://www.genescloud.cn)对所有样品的全部effective tags进行聚类，以97%的一致性将序列聚类成OTUs。根据OTUs聚类结果对每个OTU的代表序列做物种注释，得到对应的物种信息。使用Qiime软件计算Alpha多样性指数，包括Chao1、Shannon和Coverage指数，分别表征微生物群落的丰富度、多样性和覆盖度)计算，得到底泥样品物种信息。
2.3.2. 统计分析
所有数据处理采用Excel 2010软件，并使用Adobe Illustrator软件进行绘图。
3. 结果
3.1. 测序基本信息
对不同月份(3、4、5、7、8、11月)纯蟹塘(7#)和鲈鱼套养蟹塘(14#)两个塘采集到的底泥共计12个样本进行测序分析，共得到883,525条序列，每个样本的有效序列量在54,159~96,829条(表1)，99.7%的序列长度都落在401 bp~500 bp内(图1)，符合测序长度要求。经过物种注释与分析，12个底泥沉积物中的微生物涉及54个门、152个纲、343个目、589个科、1196个属和3221个种，各样本注释情况如图2所示。进一步通过97%相似度的OTU进行稀释性曲线分析(图3)，结果发现各样本曲线趋于平缓，说明测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性。
3.2. 微生物群落结构分析
在门类水平下的微生物物种组成情况如图4所示，在12个样品中，丰度最高的微生物均为变形菌门(Proteobacteria)。河蟹单养7号塘中，主要优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)等。套养鲈鱼14号塘中，主要优势菌群为变形菌门
Figure 1. Length distribution of sequencing reads
图1. 测序序列长度分布
Figure 2. Taxonomic annotation of species
图2. 物种分类学注释
Figure 3. Rarefaction curves
图3. 稀释曲线
Figure 4. Microbial community composition at the phylum level
图4. 在门类水平下的微生物物种组成
(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)等。在养殖各时期，套养塘中拟杆菌门(Bacteroidetes)丰度高于单养池塘。本研究中，鲈鱼套养塘中拟杆菌门和酸杆菌门含量与河蟹单养塘相比有所上升，硝化螺旋菌门和芽单胞菌门含量有所下降。拟杆菌门是溶解性有机物的主要消费者，养殖环境中残留饵料及养殖动物粪便在水体中未被及时分解并沉积在水体及底泥中时，会造成养殖池塘底部拟杆菌门细菌含量增加。硝化螺旋菌门有益于土壤中氮肥的利用，能有效预防水富营养化。因此，基于门水平对两种养殖模式环境微生物分析结果显示，河蟹单养池塘环境优于鲈鱼套养池塘环境，因此在实际养殖过程中应该注意维持套养池的养殖环境、预防疾病的发生。
从纲水平分析池塘底泥的组成和丰度，如图5。河蟹单养7号塘底泥中优势物种为γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)、δ-变形菌纲(Deltaproteobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、厌氧绳菌纲(Anaerolineae)、α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)、芽单孢菌纲(Gemmatimonadetes)、Subgroup_6、放线菌纲(Actinobacteria)，此。外还有少量酸杆菌纲(Acidobacteriia)和生氧光细菌纲(Oxyphotobacteria)等。除7_Jul外，其余11组第一优势物种为γ-变形菌纲，并在两种养殖模式下丰度均呈现出先升后降的趋势，在4月达到峰值。套养塘中拟杆菌纲丰度高于单养池塘，套养塘芽单孢菌纲丰度小于单养塘，与门水平一致。
Figure 5. Microbial community composition at the class level
图5. 在纲类水平下的微生物物种组成
3.3. 微生物群落α-多样性分析
根据两种养殖模式下池塘沉积物微生物群落高通量测序结果，计算各样品α-多样性指数，结果如表1所示。Chao1指数用来反映微生物群落物种丰富度，指数越大说明物种总数越多；Shannon和Simpson指数用来评价微生物群落多样性。本实验Chao1指数的变化范围在3397.61~12545.7，指数最大的3个样品依次是14_May、7_Aug、7_May，所含物种数量最大；而指数最低的3个样品是14_Apr、14_Nov、7_Nov，群落丰富度低。在养殖周期中，两种养殖模式下底泥中微生物丰富度均呈现出先升后降的趋势，单养塘8月微生物群落丰度度最高，套养塘5月和8月丰富度较高；除5月和7月外，河蟹单养塘丰富度高于鲈鱼套养塘。Shannon指数和Simpson指数在14_May、7_Aug、14_Aug的值较高，表明微生物多样性较高，种群丰富并且分配均匀。两种养殖模式下底泥中微生物群落多样性也呈现出先升后降的趋势，分别在5月和8月指数较高，与丰富度指数趋势一致，物种数量越多的养殖时间点群落结构越复杂、均一性越高。
Table 1. Summary of sequencing reads and Alpha diversity indices of microbial communities
表1. 样品序列数统计及微生物群落Alpha多样性指数表
样品 |
序列 |
Observed Species指数 |
Chaol指数 |
覆盖度 |
Shannon指数 |
Simpson指数 |
7_Mar |
87180 |
7241 |
8318.83 |
0.909821 |
11.5784 |
0.998452 |
7_Apr |
78951 |
6945.4 |
8296.87 |
0.903409 |
11.1178 |
0.99592 |
7_May |
107858 |
7599.8 |
9440.21 |
0.884982 |
11.7481 |
0.999079 |
7_Jul |
62620 |
4497 |
4800.96 |
0.961993 |
9.70707 |
0.976087 |
7_Aug |
107868 |
8917.2 |
10646.5 |
0.873105 |
12.2834 |
0.999428 |
7_Nov |
75643 |
3384.6 |
3640.94 |
0.976822 |
10.7562 |
0.998766 |
14_Mar |
86874 |
5592.7 |
6160.66 |
0.94207 |
10.9392 |
0.997936 |
14_Apr |
75164 |
2874.2 |
3397.61 |
0.965052 |
8.1447 |
0.970231 |
14_May |
118469 |
10087.2 |
12545.7 |
0.839168 |
12.5297 |
0.999525 |
14_Jul |
90955 |
7166.4 |
7758.88 |
0.928294 |
11.6259 |
0.998596 |
14_Aug |
92320 |
8137.8 |
9067.3 |
0.907415 |
12.0902 |
0.999203 |
14_Nov |
71389 |
3326.6 |
3540.93 |
0.977214 |
10.5637 |
0.998245 |
4. 讨论
微生物群落结构分析结果表明，变形菌门是养殖池塘中的优势菌门，其丰度明显高于其他优势菌丰度，变形菌门中的微生物具有一定的脱氮功能，有利于氮的去除，在养殖初期占据主导地位，随养殖过程推进逐渐减弱。拟杆菌门也是两个水体中的优势菌门，拟杆菌门的微生物与DNA、脂类和蛋白质等有机物质的转换密切相关，这些有机物质的吸收和利用共同参与水体环境中碳循环。研究发现，蟹塘套养鲈鱼导致拟杆菌门和酸杆菌门含量有所上升，硝化螺旋菌门和芽单胞菌门含量有所下降，可能是由于套养鲈鱼后养殖环境中残留饵料及养殖动物粪便增加且未得到及时分解，沉积在底泥中，营造出适合拟杆菌门和酸杆菌门细菌的生长环境，可能因此影响池塘环境[7] [8]。
蟹塘中套养鲈鱼，使得池塘中拥有更多的营养级，能量流动更充分，能够一定程度上稳定水体环境，但同时结果表明鲈鱼套养塘养殖环境底泥微生物群落丰富度和多样性略低于河蟹单养塘，这可能影响池塘生态系统的稳定，存在潜在风险[9] [10]。从经济角度来看，套养鲈鱼的养殖模式能够带来额外的经济效益，为养殖户带来增产增收，但在实际养殖过程中应该注意维持套养池的养殖环境、预防疾病的发生[11] [12]。随着养殖模式的不断创新，河蟹池塘套养已成为趋势，未来针对套养品种的选择，需要综合考虑生态和经济效益，还需要进行更多的研究。
基金项目
1) 上海市科委“科技创新行动计划”农业领域项目中华绒螯蟹绿色低碳生产技术示范应用(23N61900600)；2) 上海市中华绒螯蟹产业技术体系(沪农科产字2025第4号)。
NOTES
*通讯作者。