1. 引言
第3次全国中药资源普查显示，我国药用植物有11,146种，约占中药资源总数的87%，是我国中药材的主要药源。除200多种药用植物成功栽培外，其余多为依靠野生资源，以满足日益增长的市场需求。于1992年公布的《中国植物红皮书》收载的398种濒危植物中，药用植物占42%，有168种。
茅苍术(Atractylodes lancea (Thunb) DC.)干燥根茎为著名药材苍术，为我国道地药材，具有消炎，燥湿健脾，祛风祛湿，明目等功效。随着药源性疾病增多、对健康养生重视等变化，天然药物的开发利用日益受到重视 [1] 。本文综述茅苍术的药材分类、道地产区、栽培存在问题及生物技术手段在苍术生产中的应用等方面的研究进展，以期为解决茅苍术资源短缺问题提供理论基础和参考方案。
2. 苍术资源现状
苍术属(Atractylodes)植物是菊科多年生草本植物，全世界共有七种，主要分布于亚洲东部地区。我国有朝鲜苍术(Atractylodes. coreana (Nakai) Kitam.)，茅苍术( Atractylodes lancea (Thunb) DC.)，北苍术 (Atractylodes chinensis (DC) Koidz.)，关苍术(Atracylodes japonica Koidz. Ex Kitam.)及白术(Atractylodes macrocephala Koidz.) [2] 五种。2001年，胡世林鉴定苍术罗田亚种为茅苍术新亚种 [3] 。以上所列物种中茅苍术与北苍术被纳入《中华人民共和国药典》。多位学者 [4] [5] 从挥发油组成、RAPD技术水平上对我国苍术药材南北分类合理性进行进一步验证。茅苍术道地药材既具有类似白术的补气健脾功效，又有其他南苍术的燥湿功效。
据报道，约有80%左右的人仍依赖传统药材 [6] 。苍术为我国传统大宗药材，应用范围愈加广泛。目前国内市场和出口市场对苍术需求逐年增加，而生长土地减少，加上人们对野生苍术肆意采挖，导致市场贮藏量及野生产量逐年减少，近两年供需缺口大概有5000吨/年 [7] 。2016年苍术统货价格每公斤36~40元左右，较2000年苍术价格提高近9到10倍。道地药材茅苍术属濒危药用植物 [8] ，早已不能形成商品性销售，如今中国医药市场上的苍术主要为北苍术，约占全国总量90% [7] 。剩下10%中除少量为野生型茅苍术，其他为芍药根茎等混伪品或家种苍术。
3. 茅苍术道地药材
道地药材是指在特定自然条件及生态环境的地域内生产的药材，与其他群体相较具有更优质的药效 [9] ，所在产区即为道地产区。
苍术喜温凉、干燥气候，具耐寒耐旱能力，喜荫蔽或东坡种植，林下成活率高 [10] 。我国苍术分布于北纬30~32度、东经111~119度，所处海拔主要为60~1000 m。苍术分布区域随纬度由南向北过渡，北部不适宜苍术生长及挥发油的积累 [11] [12] 。
产于江苏省茅山地区的苍术为道地药材，一般称为茅苍术。元朝时期《瑞竹堂经验方》的苍术丸指明用产自江苏茅山的苍术。除了化学型区别，茅苍术独特地理位置、气候条件及生态环境因子也是其道地性形成的重要影响因素 [13] 。茅山道地产区属于北亚热带季风气候，主要为黄棕土壤，寒暑变化明显，四季分明，加之热量充足，无霜期长，雨量充沛，光照充足等气候要素年变化较大。
茅苍术主要药效组分为挥发油类物质，约为干重5%~9%。主成分为β-桉叶油醇、苍术酮、茅术醇等倍半萜类化合物，以及聚乙炔类化合物苍术素。其中苍术素为收藏苍术药材的含量测定指标 [14] 。袁洁等 [15] 利用GC-MS分析发现85种组分，21种含量高于1%，并成功鉴定18种组分(见表1)。茅苍术挥发油具有抗菌抑菌 [16] 、免疫调节及抗肿瘤等药理活性 [17] [18] ，可与多种药材配伍混合制成中成药、新药、中药饮片 [19] - [21] ，如藿香正气水、九味羌活口服液、苍术饮片等，也应用于饲料、兽药、杀虫剂 [22] 等。茅苍术还含有多糖、氨基酸、蛋白质等成分，多种新成分 [23] 被分离和鉴定，同时扩展了茅苍术的药效范围。
4. 茅苍术栽培现状
苍术为虫媒植物，花为雌雄同株或异株，单性花多为雌花，种子发芽率、座果率较低 [24] ，根茎增长缓慢 [13] 。单纯依靠有性繁殖，远不能满足市场对茅苍术药材的需求。有研究 [25] [26] 发现人工种子繁殖、分株繁殖、根茎繁殖可有效保护其种质资源。
Table 1. Main components of volatile oil of A.lacea
表1. 茅苍术挥发油主成分 [22]
茅苍术易染根结线虫病 [27] ，黑斑病，轮纹病、枯萎病、软腐病及白绢病等病症 [28] ，这些病菌侵染可致植株死亡，严重影响苍术质量和产量。目前主要通过药剂防治，也可幼苗时施加内生菌、盾壳霉等生物菌 [29] 进行生物防治。
组织培养可以大量扩繁茅苍术，而长期无性繁殖易使物种缺少基因交流，致品种活力退化。药材和粮食作物栽培差别在于，药材既需要积累生物量，又要积累足够的活性物质。道地药材的形成从生物学上来说是基因型与环境共同决定的产物 [11] 。虽然江苏有茅苍术种植基地，但人工栽培技术不成熟，仍存在传统中药配方疗效改变等问题。因此，需要使用生物技术手段来优化生产。
5. 生物技术手段在茅苍术生产中的应用
通过化学合成途径或直接从植株中提取药用活性成分，成本过高且影响环境，商业价值过低 [30] 。然而大量实验表明，植物生物技术如组织培养、细胞培养、基因工程及微生物生产应用等都可以高效控制生产质量 [31] ，获得目标产物。通过深入研究机理并配合优化培养手段可获得大量目标产物，有效缓解茅苍术药材市场供求不平衡。
5.1. 组织培养与细胞工程
5.1.1. 组织培养
巢建国等人初步研究了茅苍术快速繁殖的组织培养方法，根据不同种激素(6-BA、NAA、IAA、IBA、KT)及配比选出最佳分化培养基、生根培养基(表2)，各组实验结果显示，各组培养基均可建立比较完整的无性繁殖体系，为茅苍术的快速繁殖研究提供了初步的科学依据。实验结果表明培养基中激素含量及各成分比例不同显著影响植株分化生根。在继代培养中，过高或过低浓度生长素及细胞分裂素组合不利于诱导组培苗芽 [32] 。
宋艳娇等人 [36] 研究发现茅苍术生长初期大量消耗蔗糖以建成自养器官。茅苍术未成熟种胚培养可保证发芽率，且炼苗成活率高于90% [37] 。
以上研究为茅苍术组织扩繁技术研究奠定基础。元素 [38] 及激素 [39] 等培养基成分对于植株的次级代谢产物积累具有重要作用，我们的研究发现培养基中大量元素的含量配比也会影响茅苍术挥发油组分积累。
Table 2. The ratio of hormone content in the tissue culture medium
表2. 组织培养培养基中相关激素含量配比
5.1.2. 细胞培养及毛状根
细胞悬浮培养研究可为植物细胞大规模培养提供基础 [31] 。高密度细胞群体一方面可生产特定成分；另一方面可进行植物细胞代谢、生化特征等研究，以筛选突变体、人工种子等 [40] 。在制药工业中，一些价格高、产量低、需求量大化合物，如白藜芦醇 [41] 、紫杉醇 [42] 、青蒿素等植物组织代谢产物已有大量悬浮细胞研究。
方芳 [43] 首次建立茅苍术悬浮细胞系，培养周期内仅检测到β-桉叶醇，然而施加真菌诱导子后，检测出苍术酮、苍术醇、β-桉叶油醇及苍术素，表明通过条件优化，茅苍术悬浮细胞能够提高活性成分的产量。随后多项实验 [44] [45] 证实建立悬浮细胞系制备有效成分方法可行。
毛状根体系具备同样效果 [46] ，如人参皂苷的获得。袁媛等 [47] 探究诱导苍术不定根条件时证实IBA显著促进不定根生长。
但植物细胞培养存在两个阶段 [48] ：生物量积累阶段与代谢产物积累阶段。一般植物细胞培养产量不高，生产目标产物能力主要取决于培养条件 [49] (激素、糖分、温度等)和诱导子或前体的施加，与物种关系不大 [50] 。除以上培养基和种质的选择外，培养的外界条件也影响组织培养中培养物生物量和代谢物的产量。
5.1.3. 诱导培养
生物与非生物诱导子，可调节植株、植物悬浮细胞系中相应酶基因表达量，从而增加目标产物积累量 [51] 。
非生物诱导是指非细胞天然成分，如化学因子茉莉酸甲酯 [52] 、水杨酸等和物理因子如高温、低温等。Yuan等人 [53] 发现酸性土壤增加茅苍术根部密度及干重，刺激β-桉叶油醇的产生，而主根长度较短。
生物诱导子多选用植物内生菌 [54] 。内生菌能够共生定殖宿主体内，且不引发明显病症。真菌诱导子作为信号调节关键酶表达 [51] [55] 。很多天然有效成分如紫杉醇的生产过程中已应用内生真菌诱导子 [54] 。真菌诱导子诱导植物特定代谢途径具有明显种属特异性。吕立新等 [56] 发现不同种苍术有特异性内生菌，表明茅苍术的道地性与内生菌特异性相关。当茅苍术内生真菌回接，与宿主茅苍术重新建立共生关系，可明显提高组培苗的生根率、炼苗成活率，增强抗逆性 [57] ，改变茅苍术挥发油主成分含量 [58] 。高温胁迫下，AM真菌更易定殖于苍术根茎，作为诱导子促生长 [59] 。
以上结果表明添加诱导子可作为调节茅苍术药材品质的手段，能够保护茅苍术种质资源和植株扩繁。
多项实验 [60] - [64] 对内生菌诱导子诱导茅苍术植株、悬浮细胞等培养物挥发油积累信号通路进行了研究。施加真菌诱导子活化的Ca2+-CaM途径与油菜素内酯(Br)，皆可诱导一氧化氮(NO)和过氧化氢(H2O2)信号分子的增加，NO处于水杨酸(SA)和H2O2上游，茉莉酸(JA)为H2O2和NO下游信号分子，JA与H2O2显著刺激限制酶HMGR基因表达，进而促进挥发油产生。SA信号通路与JA信号通路存在互补互动。研究发现，这一过程涉及多种信号机制，诱导目的基因表达上调或下调，如HMGR和DXR [65] (见图1)，介导挥发油产生。通过诱导薄荷DXR合酶过表达，植株挥发油产量提高了50%，不同单萜的比率不变 [66] 。
近几年来，研究人员主要集中于诱导子介导宿主茅苍术生理生化机制、次生代谢成分产生方面研究。
5.2. 基因工程
茅苍术挥发油主成分是倍半萜类物质。倍半萜类生物合成 [30] 主要通过胞质中甲羟戊酸(mevalonic acid, MVA)途径，关键酶为HMGR；质体中2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2C-methyl-D-erythritol 4- phosphate, MEP)途径，也会有部分倍半萜合成，关键酶为DXP。这两个途径之间存在串扰 [67] 。萜类生物合成途径可分为C5前体异戊二烯类物质生成阶段、直接前体法尼基二磷酸等生成阶段和萜类生成及氧化、甲基化等修饰阶段 [68] 三个阶段。其中第三阶段决定萜类化合物多样性。
Figure 1. The signal transduction in Atractylodes lancea induced by endophytic fungus
图1. 内生真菌诱导茅苍术中的信号传导
在植物基因组中，萜类合酶基因数量庞大。植物转基因工程提高萜类代谢物方法主要是“开源”与“节流”：生物合成途径关键基因的过表达 [69] 、转录因子调控 [70] 、多基因共转化；抑制竞争性代谢途径等。使用可替代的亚细胞靶向 [71] 能够克服了细胞质中倍半萜生产的局限性，如将小白菊大根香叶烯合酶的靶向到烟草本塞姆氏的线粒体中并瞬时表达，大根香叶烯的产量便提高了15倍。
了解茅苍术中倍半萜类生物合成途径，有利于我们直接调控代谢生产。然而目前对于茅苍术的倍半萜合成途径基因水平研究不多。植物细胞中存在细胞器，不同细胞器之间存在信息与物质的共享，获得一株高效、稳定株系需要花费大量时间与精力。但是此方案来高效产茅苍术次生代谢物可行。
5.3. 微生物工程
部分内生菌能够合成与宿主植物相同或者相似的活性成分 [72] 。微生物发酵法生产与植物细胞生产相比较，微生物的可操控性在产业化生产方面更有前景，对于解决濒危药用植物药源危机具有重大意义。然而产苍术酮等活性成分的微生物还未有报道。因此筛选产茅苍术活性成分的内生菌或其他微生物可作为茅苍术研究热点。
随着时代进步，微生物工程生产植物次生代谢产物是更高效简便的手段。如基因导入酵母基因组中可调控代谢工程生产萜类，进而可提高酵母产植物萜类物质能力 [73] 。青蒿素半合成成功事例 [74] 标志着微生物工程生产的开端：微生物工程生产得到青蒿酸，随后青蒿酸化学合成得到青蒿素。这种由生物合成目标产物前体，再通过化学合成得到最终目标产物的方法称为半合成，这种方法能够有效解决全化学合成天然产物高成本问题。
6. 总结展望
目前野生茅苍术资源稀缺，应用生物技术可以有效繁殖和保存茅苍术资源，并有望将茅苍术有效成分产业化生产。通过茅苍术组织培养技术，可深入分析代谢产物合成途径，从基因水平调控代谢途径，以高效获得目标产物。合成途径结合微生物发酵与半合成生产，也可以避免完整植株生产周期长、活性物质含量低、细胞生物反应器不完善等问题。目前茅苍术次生代谢产物生物合成途径、所涉及的酶及信号分子都还不明确，还需要对其进一步研究，才能目标明确的运用基因工程改造茅苍术植株。
近几十年来，许多学者已经进行了一系列的研究和探索，主要集中在萜类化合物的分离、鉴定，并扩展了萜类化合物应用范围，在萜类生物合成基因方面的研究取得了巨大进步。青蒿、红豆杉等药用植物的研究发现为茅苍术的研究提供了参考。茅苍术珍贵资源的开发和保护具有巨大潜力。
基金项目
国家自然科学基金(31070443)，南京市产学研项目(编号：201306019)。
*通讯作者。