1. 前言
随着全球范围内人口老龄化趋势加剧，骨质疏松症的发病率随之不断增加，由此导致的骨缺损日益增多 [1] 。此外因交通事故、运动、创伤、肿瘤切除等原因造成的骨缺损也越来越普遍。尽管天然骨具备优异的力学性能和缺损自愈合能力，但当骨缺损的面积超过骨自愈合限度时，必须进行外科手术进行治疗，才能达到骨修复的目的 [2] [3] 。因此，如何安全有效的治疗骨缺损已成为一个重大而长期性的研究课题。其中在骨缺损修复重建过程中提供有效地应力刺激，促进骨再生修复已成为研究热点 [4] 。
磁性粒子例如Fe3O4、γ-Fe2O3等具有较好的超顺磁性，且矫顽力小、饱和磁化强度高 [5] - [7] 。利用Fe3O4的磁性刺激可以加速骨的愈合过程和新骨生成 [8] [9] ，但无法完成较大骨缺损连接。磷酸钙类骨修复材料，如羟基磷灰石(HA)、磷酸三钙等均具有良好的生物相容性和生物活性，已用于填充较大的骨缺损 [10] ，但该类材料无法提供有效的应力刺激新骨形成。据此，一些学者将磁性氧化铁和磷酸钙类材料复合，形成新型的骨修复材料 [11] - [15] ，兼具良好的生物相容性和诱导、磁力刺激新骨形成的作用 [8] [16] 。曾晓波 [17] 等采用共混–真空烧结方法将Fe3O4复合到磷酸钙多孔陶瓷中，制备了一系列超顺磁性磷酸钙复合支架，经过体内和体外实验证明这种磁性支架能显著地促进成骨细胞的增殖、分化和新骨的形成。鲍志伟 [16] 等采用共沉淀法，在室温下合成了粒径在30 nm左右、分散均匀的球形γ-Fe2O3/HA复合粒子，但其饱和磁化强度较低。徐晓虹 [18] 等研制了具有磁性的多孔陶瓷人工骨，实验结果表明此人工骨材料理化与生物学性能良好，在体内能激发骨形成，加速骨修复。Li [19] 等采用超声辅助共沉淀法制备了HA涂层的Fe3O4磁性颗粒，体外细胞实验发现其能很好地诱导骨髓间质干细胞成骨分化。由于铁磁粒子具有低稳定性以及粒径分布混杂的致命缺陷，其应用受到限制 [20] 。因此，避免Fe3O4的团聚现象，制备出成分纯净且粒径均匀的磁性羟基磷灰石颗粒为广泛应用该类材料开辟了新途径。本文以纳米四氧化三铁悬浊液为底物，通过尿素酶催化水解尿素缓慢升高Ca，P溶液pH值，从而使得HA逐渐在Fe3O4上沉积，形成具有一定紧密结构的磁性羟基磷灰石复合颗粒，其原理图如图1所示。
在化学沉积法制备磁性羟基磷灰石的过程中，溶液的离子强度、Ca/P摩尔比、表面活性剂柠檬酸铵的量等因素均对复合物颗粒的结构、形貌、大小及分布有一定的影响。课题组前期的研究已表明向溶液体系中加入质量浓度为20 g/500ml的NaCl调节离子强度利于形成完整的“核–壳”结构磁性HA复合物 [21] 。本文进一步研究溶液中Ca/P摩尔比、表面活性剂柠檬酸铵的量对Fe3O4/HA复合物颗粒的组成、形貌、颗粒大小的影响。
Figure 1. The schematic of the formation of core-shell Fe3O4/HA particles
图1. 核壳式磁性羟基磷灰石颗粒形成示意图
2. 材料与方法
2.1. 原料
氯化亚铁(FeCl2∙4H2O)，天津大茂化学试剂厂；氯化铁(FeCl3∙6H2O)、浓氨水(wt: 25%)、氯化钠(NaCl)、柠檬酸铵(C6H17N3O7)，成都科龙化工试剂厂；氯化钙(CaCl2)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、尿素，SIGMA公司；尿素酶(SIGMA type Ш)，Jack Beans公司。上述试剂均为分析纯。
2.2. 样品制备
2.2.1. 纳米四氧化三铁浆液的制备
按文献方法制备纳米四氧化三铁悬浊液 [21] 。即将氯化亚铁(FeCl2∙4H2O)和三氯化铁(FeCl3∙6H2O)按2:3的摩尔比溶于去离子水中，移入500 ml三颈瓶中，加入一定量的浓氨水(25 wt%)，在氮气保护下于70℃水浴中快速搅拌反应0.5 h。待反应结束后，用磁铁吸引迁移作用分离悬浊液中磁性颗粒，用去离子水反复洗涤至中性，再将纳米四氧化三铁分散于水中，超声30 min，即制得所需黑色纳米级四氧化三铁悬液，备用。
2.2.2. Fe3O4纳米粒子的改性
以柠檬酸铵为分散剂，取上述黑色四氧化三悬浊液加入到已进行通氮除氧的500 mL质量浓度分别为1 g/L、3 g/L、6 g/L的柠檬酸铵溶液中，超声20 min，使四氧化三铁纳米颗粒充分分散，获得均匀的四氧化三铁的悬浮液。
2.2.3. 不同Ca、P比溶液中制备磁性磷灰石
将一定量的氯化钙(CaCl2)、磷酸氢二钠(Na2HPO4)、尿素和氯化钠(NaCl)分别按Ca，P原子比1:2、5:3、10:3配成400 ml Ca，P溶液，用稀盐酸调节PH至5，加入均匀分散的纳米四氧化三铁悬浊液，混合均匀，将该混合浆液放入37℃水浴中，匀速搅拌30 min，加入相应量的尿素酶，反应72 h。反应停止后，用去离子水洗涤至中性，冷冻干燥48 h，得到磁性羟基磷灰石复合物。
不加入纳米四氧化三铁悬浮液，在上述Ca、P溶液条件下自然沉积即得到纯羟基磷灰石。
2.3. 材料表征
表征方法：通过XRD (DX-2500型，中国丹东方圆公司) (0.2˚/min，2θ范围为10˚~70˚)表征材料的组成及结晶结构；采用SEM (JSM-6510LV，日本电子株式会社)和TEM (JEM 100CX П型，日本电子株式会社)观察样品形貌。将制备的磁性HA浆料置于玻璃瓶中，在一侧放置磁铁，数码相机记录材料的磁响应行为。
3. 结果与讨论
3.1. Ca、P摩尔比对复合物颗粒的影响
羟基磷灰石的生成依赖于Ca、P溶液的PH值，本文将尿素溶解于含有Fe3O4纳米颗粒的Ca、P溶液中，采用尿素酶催化水解尿素所生成的氨气使Ca、P溶液体系的pH逐渐升高的均相沉积法制备磁性HA复合颗粒。图2为不同Ca/P摩尔比条件下制备的Fe3O4/HA复合物的XRD图谱。图中2θ分别为35.5˚、53.6˚、62.7˚与Fe3O4标准JCPDS卡片的(311)、(422)、(440)晶面衍射相对应，表明所得产物并没有改变Fe3O4的立方晶型结构，复合物的磁性得以维系。2θ分别为25.9˚、31.8˚、39.7˚的特征峰与HA标准JCPDS卡片的(002)、(211)、(310)晶面特征衍射峰对应 [22] [23] ，表明该方法成功合成了HA。图2(a)中可同时观察到Fe3O4和HA较强的特征峰，表明当溶液中Ca/P为1:2时，尽管可以形成HA，但生成的HA不能完全包覆纳米Fe3O4颗粒，仍可观察到较强的Fe3O4特征衍射峰。而图2(b)中HA的特征峰完整且尖锐，Fe3O4特征峰与图2(a)相比明显减弱，说明Ca/P摩尔比为5:3时，HA很好地沉积包覆Fe3O4，形成了稳定的核壳结构复合物。图2(c)中除了Fe3O4和HA的特征峰以外，在2θ = 29.4˚还存在较强的CaCO3特征衍射峰，说明当Ca/P摩尔比为10:3时，由于溶液中Ca2+过量，当尿素水解产生CO2与过量的Ca2+反应，生成CaCO3。因此Ca/P摩尔比5:3为该体系制备核壳结构磁性Fe3O4/HA的最佳配比。
3.2. TEM分析
图3为制备的纯HA、Fe3O4纳米颗粒和Fe3O4/HA复合物的TEM照片。图3(a)为Ca/P摩尔比为5:3制备的HA的TEM照片，由图可看出纯羟基磷灰石呈针状晶体；图3(b)显示制备的纳米四氧化三铁颗粒呈圆球状；图3(c)为本实验运用均相化学沉积法合成的Fe3O4/HA复合物的TEM图像，可以看出复合物呈球状，尺寸较纯Fe3O4大了近3~4倍，没有观察到呈针状的羟基磷灰石晶体，说明该方法所制备的复合物为球状核壳结构颗粒。比较图3(a)和图3(c)可知，在此反应条件下，Ca、P溶液中不加入Fe3O4纳米颗粒，反应得到典型的针状HA晶体，表明均相沉淀反应生成的HA仍为向C轴择优生长的趋势。当在Ca、P溶液中加入纳米Fe3O4悬浊液，纳米Fe3O4颗粒作为成核位点，HA在纳米Fe3O4表面沉积，形成了核壳结构的复合颗粒。
3.3. 磁性羟基磷灰石复合物磁相应行为
为了验证制得的Fe3O4/HA复合物的磁响应性，我们利用简单的磁铁吸引来做初步验证。如图4所示，Fe3O4/HA复合物悬浮液在磁铁的吸引下，悬浮颗粒迅速的移向磁铁一边，左侧液体变得较为澄清，表明用该方法所制备的Fe3O4/HA复合物具有明显的磁相应行为。
3.4. 柠檬酸铵分散剂对磁性羟基磷灰石颗粒的影响
图5为本实验在不同的柠檬酸铵质量浓度(每500 ml溶液中所含柠檬酸铵的质量)下所制备的Fe3O4/HA复合物的SEM图片。图5(a)为悬浊液中不加柠檬酸铵制备的Fe3O4/HA复合物，由图中可看出复合物为规则的球形颗粒，尺寸约为30 μm，而初始模板Fe3O4颗粒尺寸仅约为20 nm，说明在沉积过程中，HA内部包含多个或团聚的Fe3O4颗粒，导致最终形成复合物尺寸较大。图5(b)、图5(c)、图5(d)分别为Ca、P溶液中加入不同浓度的柠檬酸铵制备的Fe3O4/HA复合物，对比图(a)可看出，复合物尺寸明显减小，说明在沉积过程中，柠檬酸铵作为分散剂，一定程度上减弱了Fe3O4的团聚，从而导致最终形成的Fe3O4/HA复合物颗粒变小。
分散剂的最佳用量与具体的制备工艺和基液性质密切相关。柠檬酸铵用量过低时，纳米粒子包覆不完全，会导致磁性液体稳定性较低，团聚现象严重，形成的复合物结构较为混乱。随着柠檬酸铵用量的
Figure 2. XRD patterns of Fe3O4/HA composites fabricated at different Ca/P molar ratio: (a) Ca/P = 1:2, (b) Ca/P = 5:3, (c) Ca/P = 10:3
图2. 不同Ca/P摩尔比制备的Fe3O4/HA复合物的XRD图谱：(a) Ca/P = 1:2，(b) Ca/P = 5:3，(c) Ca/P = 10:3
Figure 3. TEM images of (a) pure HA, (b) Fe3O4 nano-particle and (c) Fe3O4/HA composite
图3. (a) 纯HA，(b) Fe3O4纳米颗粒和(c) Fe3O4/HA复合物的TEM照片
Figure 4. Digital images of (a) Fe3O4/HA composite suspension and (b) suspension near a magnet
图4. (a) Fe3O4/HA复合物悬浮液和(b)悬浊液靠近磁铁后的数码照片
Figure 5. SEM images of Fe3O4/HA composites with different mass concentration of ammonium citrate: (a) 0 g, (b) 0.5 g/500ml, (c) 1.5 g/500ml and (d) 3 g/500ml
图5. 不同柠檬酸铵质量浓度下制备的Fe3O4/HA复合物的SEM图像：(a) 0 g，(b) 0.5 g/500ml，(c) 1.5 g/500ml和(d) 3 g/500ml
增加，磁性液体稳定性逐步增大，到达一定值后，纳米粒子包覆较为完全，分散作用最好。继续增大柠檬酸铵的用量，由于会形成多层吸附，从而磁性液体稳定性又开始降低。从图中可看出，在本实验中，当柠檬酸铵的质量浓度为1.5~3.0 g/500ml (图5(c)和图5(d))时，复合物呈现球状结构且尺寸较小。
综合XRD、TEM和SEM的分析可知，选择合适的Ca/P摩尔比和分散剂用量，能够制得具有相对稳定核壳结构的磁性羟基磷灰石颗粒。这种复合结构中，内核可能是单个或多个Fe3O4磁性粒子，完全被羟基磷灰石包埋形成典型的核壳结构。
4. 结论
以柠檬酸铵为分散剂改性Fe3O4获得的高分散纳米Fe3O4颗粒为核，以尿素为均相沉淀剂，通过尿素酶催化水解尿素改变Ca、P溶液PH值，均相沉积羟基磷灰石包覆纳米Fe3O4颗粒，成功制得核壳结构的磁性Fe3O4/HA复合颗粒，并探究了工艺条件对复合颗粒组成、结构和颗粒尺寸的影响。实验发现当溶液中Ca/P摩尔比为5:3，分散剂柠檬酸铵用量为1.5~3.0 g/500ml时，Fe3O4磁性粒子基本完全被沉积的羟基磷灰石包覆，可制得颗粒尺寸较小的球状核壳结构磁性Fe3O4/HA复合物。该方法简便易行，可用于宏量制备磁性Fe3O4/HA复合颗粒。
基金项目
国家高技术研究发展计划项目(863计划) (2013AA032203)；四川大学优秀青年学者基金(2014SCU04A20)。
*通讯作者。