1. 引言
香豆素类化合物(Coumarins)是具有苯骈α-吡喃酮母核的一类天然化合物的总称，在结构上可以看成是一类由顺式邻羟基桂皮酸分子内脱水环化内脂化合物。香豆素广泛存在于植物界，为高等植物的次生代谢产物，具有芳香气味，其中以伞形科和芸香科植物中分布最多，菊科、豆科、瑞香科、木犀科等次之，少数来自微生物。在植物体内，香豆素类化合物常常以游离状态或与糖结合成苷的形式存在，大多存在于植物的花、叶、茎和果中，通常以幼嫩的叶芽中含量较高。传统中药蛇床子、秦皮、白芷、祖师麻、前胡等含有丰富的香豆素。香豆素类化合物具有抗HIV、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗菌等多方面的生物学活性，受到国内外学者的广泛关注 [1] - [6] 。从结构上划分，香豆素包括简单香豆素、呋喃香豆素、吡喃香豆素和其他类香豆素(如图1)。
现阶段香豆素的分析方法主要有薄层色谱法、紫外–可见分光光度法、高效液相色谱法、气相色谱法，荧光分析法和荧光成像法等。表1为文章中所涉及到主要药用植物及香豆素种类。
Figure 1. Structure types of Coumarins
图1. 香豆素的结构类型
Table 1. Coumarins in medicinal plants
表1. 药用植物中包含的香豆素
2. 薄层色谱法
薄层色谱法(TLC)是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在流动相(溶剂)流过固定相(吸附剂)的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术手段，主要用于药品的鉴别、杂质检查、含量测定和跟踪化学反应进程等。
草木樨是豆科草木樨属(Melilotus L.)的一年生和二年生草本植物，草木樨植株中含香豆素(Coumarin)有机成分，若在收割后保存不妥，易发霉变质，会使双香豆素(Dicoumarin)含量增加(结构如图2中所示)。双香豆素具有箭毒样作用，过量的双香豆素进入动物机体会对抗维生素K，并且抑制肝脏凝血酶原形成，进而导致全身发生出血性疾患甚至导致动物死亡。万碧秋等人利用薄层色谱法分离了草木樨中的双香豆素并且采用紫外分光光度计测定了其含量 [7] [8] 。
羌活为伞形科羌活属药用植物，主治性温，祛寒湿，用于外感风寒、头痛无汗、寒湿痹、上肢风湿疼痛等症状。羌活中主要含有挥发油、香豆素类、氨基酸、微量元素等物质。羌活和宽叶羌活均含有紫花前胡苷，鉴别和评价羌活和宽叶羌活药材质量时，可采用薄层色谱法对紫花前胡苷进行定性鉴别 [9] [10] ，该方法已经写入2010版和2015版中国药典。
薄层色谱法操作简单，成本低，混合样品中吸光或荧光组分较少时，分离测定效果良好，但理论塔板数较低，比移值Rf相差较小的组分不易分开而导致定量有偏差。
Figure 2. Structures of various coumarins in medicinal plants of this review
图2. 本综述中药用植物中的香豆素结构
3. 紫外–可见分光光度法
紫外–可见分光光度法应用范围很广，可用于定性、定量和结构分析，具有操作简单、准确度高、重现性好的优点。
6,7-二甲氧基香豆素作为香豆素类化合物的一种，具有多种药理活性：1) 有明显的保肝、利胆功效；2) 控制血管扩张和低血压、抑制免疫、抗动脉粥样硬化、抗心绞痛；3) 免疫抑制和降压作用。此外6,7-二甲氧基香豆素还有抑制癌细胞增长、抗肿瘤等作用。中药茵陈具有保肝利胆、降血脂、抗凝血和抗病毒等药理作用。朱传先等应用紫外分光光度法对中药茵陈中的6、7-二甲氧基香豆素的含量测定，并同薄层层析—紫外分光光度法作了比较。实验表明，用紫外分光光度法测定茵陈提取物中蒿属香豆精的含量较为快速、稳定、简便 [11] 。
何方奕等为了测定无梗五加果中总香豆素及6,7二甲氧基香豆素的含量，以东莨菪内酯为对照品，采用分光光度法，于348 nm处测定总香豆素含量。采用HPLC法测定6,7二甲氧基香豆素含量。实验结论证明该方法准确、可靠，可为无梗五加果的质量控制提供参考依据 [12] 。
独活为历次版本《中国药典》收载的常用中药，具有祛风除湿、通痹止痛等功效，主要用于风寒湿痹、腰膝疼痛等症。现代研究表明，香豆素类化合物是独活中所含的最主要活性成分，其中又以蛇床子素含量最高，有镇静催眠，镇痛抗炎，扩张血管，抑制血小板聚集和抗血拴形成等作用，从而产生活血通络之功效。张恭孝等以蛇床子素为对照品，采用紫外分光光度法测定了独活中总香豆素含量 [13] 。研究结果表明：检测波长为322 nm，蛇床子素质量浓度在2~12 mg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系(r = 0，R = 0.9996)，平均回收率99.18% (RSD = 1.69%, n = 6)。实验证明该方法简便易行，结果稳定可靠，可用于独活及其制剂的质量控制。
白芷为伞形科植物白芷或杭白芷的干燥根，具有解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍，燥湿止带、消肿排脓之功效。梁玉玲等以欧前胡素为对照品，检测波长为300 nm，利用紫外－可见分光光度法检测了白芷愈伤组织和白芷药材中总香豆素的质量分数，结果表明：欧前胡素的质量浓度在3.0~30.0 µg/mL (R = 0.999)内与吸光度呈良好的线性关系，白芷愈伤组织中总香豆素的质量分数是白芷药材中的9.7倍，为药用植物白芷的植物生物技术开发和利用提供了依据 [14] 。
紫外-可见分光光度法，操作简便，运行成本较低，但是采用分光光度法只能测量样品中的总香豆素含量，不适合测定某一组分的含量，不能适应中药复杂体系的分析的要求。
4. 色谱法
4.1. 高效液相色谱法(HPLC)
在香豆素类物质的检测中，高效液相色谱应用最为广泛，常配以二极管阵列检测器(DAD)、紫外检测器(UV)或者荧光检测器(FI)，选择合适的色谱柱、流动相及检测波长，是实现分离的关键因素。目前在检测香豆素时广泛使用的是反相C18柱。流动相一般选择甲醇、乙腈、水和冰醋酸等，针对不同的物质选择不同配比的流动相。
《中国药典》2010年版规定，欧前胡素为白芷定量指标，但是单一指标无法满足实际需要。异欧前胡素、氧化前胡素也是白芷中的主要活性成分且含量较高，应同时作为其质量控制的指标才更具合理性。杨芳等采用 HPLC-DAD方法建立了川白芷中欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素的“一测多评” 含量测定方法，测试过程中只用一个对照品欧前胡素同步测定川白芷中的3个成分。同时采用外标法作为对照。研究结果表明基于HPLC的“一测多评”法可以有效控制川白芷药材的质量 [15] 。
秦皮，为木犀科植物苦枥白蜡树、白蜡树、尖叶白蜡树或宿柱白蜡树的干燥枝皮或干皮，具有清热燥湿，收涩止痢，止带，明目之功效。研究表明，秦皮的主要有效成分为香豆素类化合物。叶迎等以秦皮甲素为对照品 [16] ，采用紫外可见分光光度法在334 nm测定秦皮提取物总香豆素的含量；采用HPLC方法，乙腈-0.01%磷酸溶液为流动相梯度洗脱，在334 nm测定秦皮提取物中秦皮甲素、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素4种主要香豆素成分的含量。该方法简便、准确、可靠，可用于秦皮提取物总香豆素和主要香豆素成分的质量控制。冯伟红等 [17] 采用HPLC方法以秦皮甲素为参照物建立了秦皮中秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素的“一测多评”含量测定方法，同时采用外标法作为对照。研究结果表明基于HPLC的“一测多评”法可以有效控制秦皮药材的质量。
白花蛇舌草为茜草科耳草属植物，具有清热、解毒、消肿、止痛之功效。现主要用于抗癌治疗与研究。香豆素类化合物为其主要有效成分之一，其中东莨菪亭和耳草酮 B具有抑制PC3和Hep G2细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用。于亮等采用HPLC方法比较不同产地白花蛇舌草中两种香豆素类成分东莨菪亭(7-羟基-6-甲氧基香豆素)和耳草酮B的含量 [18] ，研究表明江西产药材中两种香豆素类成分的含量明显高于湖北、安徽、广西其它三个产地的药材，为完善白花蛇舌草药材质量标准提供参考依据。
在高效液相色谱的基础上发展起来的液质联用技术(HPLC-MS)，集合了质谱的高灵敏度和选择性，以及高效液相色谱的优点，被认为是目前效果最好的分析手段，香豆素可以作为复杂混合物的一个或几个组分被检出。张薇等 [19] 采用液相色谱–串联质谱分析法对中药白芷中欧前胡素，异欧前胡素和氧化前胡素，北沙参中佛手柑内酯和花椒毒酚和补骨脂中补骨脂素和补骨脂定的同时测定，考察了所建方法的线性范围、精密度、检出限和准确度，建立了香豆素的分析检测方法。
4.2. 气相色谱法–质谱联用(GC-MS)
气相色谱是一种对易于挥发而不发生分解的化合物进行分离与分析的色谱技术，主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。香豆素物质具有挥发性，能够在气相条件下实现分离。
蛇床子为伞形科植物蛇床的干燥成熟果实。蛇床具有燥湿祛风、杀虫止痒、温肾壮阳之功效，常用于治疗阴痒带下、湿疹瘙痒、湿痹腰痛、肾虚阳痿和宫冷不孕等症。蛇床子主要含有香豆素类、黄酮类、挥发油类以及有机酸类化合物，其中香豆素类化合物是影响其药理学活性的主要因素。宋更申等采用GC-MS方法同时测定了12批不同产地蛇床子中异补骨脂素、花椒毒素、佛手柑内酯、蛇床子素、异茴芹内酯、欧前胡素和二氢欧山芹醇等7中香豆素的含量 [20] 。该方法简便、快速、灵敏度度高、专属性好，为蛇床子药材的质量控制提供依据。
此外，李玲等采用GC-MS方法鉴定出川白芷中含有氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素等11中香豆素，为川白芷香豆素有效部位的临床疗效与所含化学成分的相关性研究提供了科学实验依据 [21] 。
4.3. 毛细管电泳法(CE)
毛细管电泳是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。高效毛细管电泳法具有分离效率高，分析时间短、运行成本低、对环境污染小等优势，目前该技术在分析香豆素物质的应用较少。张琦等建立了秦皮中主要活性成分秦皮苷、秦皮甲素、秦皮乙素的毛细管区带电泳快速同时定量方法 [22] 。
4.4. 超高液相色谱法(UPLC)
超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)是在高效液相色谱法之上发展起来的，它借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。
杨英来等 [23] 建立了超高效相液相色谱法同时测定浓缩当归丸和当归药材中光毒性化合物补骨脂素、花椒毒素和佛手柑内酯含量的方法，该方法简便、快速(10分钟内)、精密度高、重现性好。
朱芸等 [24] 利用超高液相色谱法测定了分布于新疆的不同生长时期多伞阿魏中倍半萜烯香豆素的含量，研究结果表明生长在5月9日的多伞阿魏中倍半萜烯香豆素的含量最高，该方法准确可靠，重复性好，能够用于多伞阿魏的质量控制。
4.5. 超临界流体色谱法(SFC)
超临界流体色谱(supercritical fluid chromatography; SFC)以超临界流体做流动相，依靠流动相的溶剂化能力来进行分离、分析的色谱过程。超临界流体色谱兼有气相色谱和液相色谱的特点，它既可分析气相色谱不适应的高沸点、低挥发性样品，又比高效液相色谱有更快的分析速度。操作温度主要决定于所选用的流体，常用的有二氧化碳及氧化亚氮。SFC技术在天然产物方面的分析分离应用还比较少，Pfeifer等 [25] 采用SFC技术同时分离分析了白芷中的当归素、蛇床子子素、王草素、花椒毒素、异欧前胡素、氧化前胡素、花椒毒酚和伞形花内酯8种香豆素，该方法非常快速，分析时间仅需要6分钟，而采用GC, HPLC, CE等方法需要20分钟以上。这种快速绿色的方法在天然产物分离分析方面具有独到的优势。
5. 荧光分析法
荧光分析法是根据物质的荧光光谱位置及其强度进行物质的鉴定和含量测定的仪器方法。荧光现象与物质的分子结构和含量有关。物质的分子结构不同，发射荧光的波长也不同，据此可对物质进行定性鉴定；荧光物质的含量(浓度)不同，发射荧光的强度不同，据此可对物质进行定量分析。荧光分析法具有高灵敏度、低检测限、高时空分辨能力以及可进行实时原位检测等优势，已广泛应用于化学、生命、环境、食品、医药分析等领域 [26] 。荧光光谱包括普通的二维荧光光谱和三维荧光光谱。二维荧光光谱指的是固定激发波长扫描发射波长所得的发射光谱和固定发射波长扫描激发波长所得的激发光谱。而三维荧光光谱反映了发光强度同时随激发波长和发射波长变化的情况，使三维荧光图谱能够完整的描述物质混合体系的全部荧光信息，使之成为光谱识别、表征的必要条件。还可以从更完全的信息中寻找选择性区域，对一个含多组分的荧光光谱重叠的对象，来解决组分之间的干扰问题。三维荧光光谱分析法作为一类混合物质体系同时综合分析的优势分析方法，具有分析速度快，结果可靠稳定、信息丰富、适于现场操作等优点，不仅能够在一定程度上对混合体系中特定的一些物质作定性定量分析，而且能够对混合体系的整体特征进行刻画 [27] [28] [29] 。
香豆素的多种衍生物有荧光现象，更具有荧光量子产率高和光稳定性好等优点。近年来，香豆素类荧光染料及荧光探针倍受关注，是目前化学、环境和生命科学等领域中研究与应用的一类重要荧光材料，为香豆素的荧光分析检测方法提供基础。
李云等 [30] 系统研究了秦皮中秦皮甲素和秦皮乙素的荧光光谱性质和紫外-可见吸收光谱性质，利用秦皮甲素和秦皮乙素在不同pH条件下荧光性质的差异性，建立了中药秦皮中同时测定这两种香豆素的荧光分析方法，分别利用标准曲线法和标准加入法测定了秦皮甲素和秦皮乙素在中药秦皮中的含量。
吴海龙等 [31] 采用三维荧光分析结合交替三线性分解算法对秦皮中药成分秦皮甲素和秦皮乙素进行定性定量分析，多次测定结果的相对误差分别为2.01%和2.21%，由于中药成分比较复杂，利用色谱方法分离时需要摸索最佳的分离条件，耗时耗力；而传统的二维荧光光谱法，由于中药中其他组分荧光光谱的干扰，无法直接测定。该方法克服了传统色谱法和荧光法的优点，为直接测定秦皮甲素和秦皮乙素提供了一种快速简洁的方法。
藏药绵头雪兔子(学名：Saussurealaniceps)为菊科风毛菊属的植物，是中国的特有植物。具有除寒，壮阳，填精，止血等功效。常用于雪盲，牙痛，风湿关节痛，阳痿，月经不调，崩漏，带下病等症治疗。研究表明伞形花内酯，东莨菪亭等为藏药绵头雪兔子和中药独活的主要活性成分。吴海龙等 [32] 采用三维荧光分析结合交替三线性分解算法对伞形花内酯，东莨菪亭这两种香豆素进行了同时测定，检测限分别为0.06 ng∙mL−1和0.16 ng∙mL−1。并采用HPLC-DAD方法对实验结果进行了验证，结果表明，相对于HPLC-DAD分析方法，该方法快速，灵敏度高，运行成本较低，为藏药绵头雪兔子和中药独活的质量标准控制提供新的方法。
6. 荧光成像法
激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope, CLSM)综合普通光学显微镜和荧光显微镜的功能，并配备微机数字化分析系统和电子摄影系统，是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。它使用紫外光或可见光激发荧光物质，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。目前，激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段。结合其他相关生物技术，该成像技术已经在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用 [33] [34] [35] 。近年来，激光扫描共聚焦显微在植物学中也取得了系列进展，成功应用于植物中某些荧光成分的分析和组织定位。近年来，激光扫描共聚焦显微成像技术在植物中香豆素的荧光成像分析方面也取得一些进展 [36] [37] [38] [39] 。
球花石斛为传统名贵中药，香豆素类化合物为其主要有效成分之一，该类成分具有松弛平滑肌、扩张血管及抗凝血等功效。石斛以茎入药，叶和根在药材采收加工过程中废弃。郑艳等以大黄素、泽兰内酯、东莨菪内酯和滨蒿内酯这四种香豆素为参照，首先利用激光扫描共聚焦显微成像技术观察了二月份采收的球花石斛1~3龄茎的基部、中部和顶部的香豆素的含量变化情况 [40] 。所记录数据经正态性、方差齐性检验后进行方差分析，并使用Tukey’s检验做多重比较。结果表明香豆素类成分主要分布在球花石斛茎的维管束部位并以维管束外侧纤维的壁较多。然后他们又采用该方法观察了球花石斛营养生长期和生殖生长期的叶、根中香豆素的含量 [41] 。球花石斛的叶除叶脉近上、下表皮处的维管束纤维群外，其他部位均有香豆素类成分的存在。球花石斛根的各部位均有香豆素类成分存在，尤其在皮层以内细胞的壁和壁内周。球花石斛叶、根的香豆素类成分的相对含量在生殖生长中的盛花期均高于营养生长期；在生殖生长进入始果期二者均几无香豆素类成分分布。该方法实现了对香豆素成分的组织定位和相对定量分析，为合理评价和利用药用球花石斛提供了科学依据。
明党参Changiumsmyrnioides Wolff为历版《中国药典》的名贵中药，是我国特有的伞形科(Umbelliferae)明党参属(Changium)的单种属植物，具有润肺化痰、养阴和胃、平肝解毒之效。香豆素类化合物为其主要有效成分之一，张莹等以珊瑚菜内脂为对照，利用激光扫描共聚焦显微成像技术考察了明党参不同器官中香豆素含量的组织定位、分布及相对含量变化规律 [42] 。研究表明党参根、茎、叶、果实中均合香豆素类成分，分泌道是明党参中香豆素积累的主要场所。研究结果为科学评价、合理采收及利用明党参提供依据。
7. 结语与展望
目前药用植物中香豆素的分离分析方法主要是HPLC、HPLC-MS和GC-MS方法，这是因为该方法能够很好的满足定性和定量的要求。在HPLC基础上发展起来的UPLC技术一种快速分离分析方法，能够大大缩短分析时间，提高分析通量。但是色谱操作繁琐，需要训练有素的仪器操作人员，分析运行成本较高。荧光分析法具有高灵敏度、低检测限和操作简单等优势，可以直接对某些香豆素进行定量分析。对于复杂样品还可以采用荧光光谱法与化学计量学相结合的方法，对目标组分进行定性定量分析。此外，三维荧光光谱分析法作为一类混合物质体系同时综合分析的优势分析方法，还可以用于含有多种荧光香豆素的样品分析和含量测定。激光扫描共聚焦显微荧光成像技术能够实现植物不同器官中香豆素含量的组织定位、分布及相对含量变化测定。荧光分析与荧光成像技术在药用植物中香豆素的分析方面可能有广阔的应用前景。
基金项目
甘肃农业大学伏羲青年新秀引进人才项目(GSAU-RCZX201704)和甘肃农业大学学生科研训练计划项目(SRTP20170103 & 20170104)资助。
NOTES
*通讯作者。