1. 引言
结直肠癌(CRC)是我国常见恶性肿瘤之一,其死亡率在全部恶性肿瘤中持续位居前5位,文献报道2015年男性新增患病人数21.57万,女性新增16.06万,男性死亡人数为11.11万,女性为8万 [1] ,对人类健康及生命造成严重威胁。近年来,抗血管治疗无论在基础研究还是临床应用中都取得了一定的成果,如贝伐单抗是美国食品药品管理局批准的一线治疗CRC的重组人源化单克隆抗体,但靶向抗肿瘤血管药物却存在价格昂贵、容易出现不良反应及药物耐药等缺点。我国传统中医药治疗肿瘤具有提高机体整体的抗瘤能力及多靶点的特点,同时中药价格低廉,毒副作用小,联合治疗可以减轻靶向药物的毒副作用,可望弥补此类药物的缺陷 [2] [3] 。本课题组前期实验结果表明LBP可抑制自发性乳腺癌MMTV-PyMT小鼠肿瘤生长,并抑制肿瘤细胞增殖和血管新生 [4] ,LBP是否对结直肠癌肿瘤具有同样的作用?其具体作用机制是什么需要深入探讨。
2. 仪器和材料
2.1. 仪器
二氧化碳培养箱(美国Thermo公司);超净工作台(苏州净化),白光拍摄显微镜(奥林巴斯日本)。
2.2. 实验动物与细胞
6~8周SD大鼠6只,雌性,体重(200 ± 20) g,购于广东省医学实验动物中心,许可证号:SCXK (粤) 2013-0002。
6~8周Balb/c小鼠16只,雄性,体重(20 ± 2) g,购于广东省医学实验动物中心,许可证号:SCXK (粤) 2013-0002。实验动物饲养于室温20℃~26℃,相对湿度40%~70%的环境中,昼夜明暗光照时间(12 h明/12 h暗)。
小鼠结直肠癌细胞CT26和人真皮微血管内皮细胞HDMEC由本实验室保种。
2.3. 实验药物与试剂
LBP (质量分数大于50%)购于中国西安开来生物工程有限公司,生产批号:K140828;CD31抗体购于Abcam公司,免疫组化抗兔二抗购于中国北京中杉金桥生物技术公司;PCR引物由中国英潍捷基公司合成,DAB购于美国CST公司;Matrigel购于美国BD公司,SYBR Green Mix和逆转录试剂盒购于Takara公司。
3. 方法
3.1. 建立小鼠结直肠癌模型
小鼠随机分为对照组和实验组,每组8只,将对数期生长的CT-26细胞按照每只小鼠2 × 105/0.2ml接种于小鼠左侧腋前皮下。4天后可看到肿瘤长出,开始给药,依据实验室之前研究基础 [5] [6] ,选取最佳给药浓度为50 mg∙kg−1,腹腔注射,每2天给药1次,游标卡尺测量肿瘤的长短径1次/2天,绘制肿瘤生长曲线,共给药12天。在给药结束后,脱臼处死小鼠,肿瘤剥离后称重,放入体积分数为 10%甲醛溶液固定24小时,常规脱水石蜡包埋、病理制片。
3.2. 免疫组化染色
常规脱蜡–切片,PBS洗3次,每次5分钟,柠檬酸钠修复液(PH 6.0)高温高压热修复8分钟,自然冷却后放入3% H2O2甲醇溶液37℃浸泡30分钟,PBS洗3次,每次5分钟,加10% BSA封闭,加CD31一抗置于4℃过夜;将组织切片从封闭盒中取出继续孵育1小时,PBS洗3次,每次5分钟;滴加二抗置于室温孵育1小时,PBS洗3次,每次5分钟;DAB显色10秒,流水冲;苏木素复染30秒,流水冲。常规脱水,中性树胶封片,自然晾干。每次实验设立阳性和阴性对照 [4] 。
3.3. 大鼠动脉环实验
6~8周龄SD雄性大鼠,乙醚麻醉后脱臼处死;将大鼠浸泡于75%酒精中2分钟,打开胸腔,沿脊柱剪下大鼠胸主动脉;将血管置于大培养皿中,加入无菌PBS洗3遍,除去血液,剥离剔除血管周围结缔组织,将血管剪成1 mm高圆环;用4℃预冷中枪头加matrigel 100 μL入48孔板中,避免气泡产生,轻轻拍打使其分布均匀,放入37℃细胞培养箱中15分钟使matrigel凝固;将剪好的血管环放入凝固的matrigel中,使其位于中央,再加入matrigel 100 μL,避免气泡,放入37℃细胞培养箱中15分钟使matrigel凝固。根据预实验,选取LBP药物浓度为500 μg/mL及1000 μg/mL两个浓度,用EBM培养基配制,500 μL/孔,每天观察血管生长情况,8天后,向48孔板中加入4%多聚甲醛固定液,室温固定30分钟后拍照。
3.4. QPCR检测HUMED中BAI1基因的表达
细胞培养,对数期生长的细胞汇合度达到90%,消化,计数,于1.0 × 105/孔铺六孔板。第二天,弃掉培养基,用EBM培养基配置500 μg/mL的LBP为给药组,对照组加入相同体积的EBM培养基,培养48小时。48小时后,弃掉培养基,PBS洗3次,弃掉PBS;RNA提取、逆转录严格按照试剂说明书进行,cDNA用DEPC稀释8倍后,按照试剂盒说明进行操作分析。
利用Primer5.0进行引物设计,BAI1引物序列如下:
Primer 15′-CAGAGGAGCAGGTGGACAGAGAAAG-3′
Primer 2 5′-TCAGGA GACAGTGGAAGCAGCG-3′。
3.4. 数据处理
肿瘤组织血管密度采用Image pro plus软件对结果进行处理,血管环周长用ipp软件计算。所有数据采用GraphPad Prism 5.0软件作图。数据以mean ± SD表示,两组间用两独立样本t检验方法,P < 0.05具有统计学差异。
4. 实验结果
4.1. LBP对CT26小鼠结直肠肿瘤生长的作用
LBP给药组CT26结直肠癌小鼠肿瘤体质量为(0.31 ± 0.04) g小于对照组(0.63 ± 0.06) g (P < 0.05) (见图1(A));绘制肿瘤生长体积曲线,发现枸杞多糖LBP可抑制小鼠肿瘤的生长(P < 0.05) (见图1(B))。
Figure 1. The effect of LBP on colorectal cancer growth in mice *P < 0.05, **P < 0.01
图1. LBP对小鼠结直肠癌肿瘤生长的影响*P < 0.05,**P < 0.01
4.2. LBP对结直肠癌小鼠肿瘤间质血管的影响
CD31单抗免疫组织化学染色检测肿瘤组织中的血管密度,并在200×高倍视野(HP)下计数血管数目,发现LBP给药组血管数(31.6 ± 2.45)/HP明显少于对照组(42.3 ± 3.28)/HP (P < 0.05),表明LBP可抑制肿瘤血管的形成(见图2)。
Figure 2. The effect of LBP on tumor vascular formation
图2. LBP对肿瘤血管形成的影响*P < 0.05
4.3. LBP对大鼠动脉环血管形成的影响
观察动脉环周围的新生成的血管数量发现,LBP给药剂量分别在500 μg/mL和1000 μg/mL时血管数明显少于对照组,表明LBP对大鼠动脉环血管形成具有抑制作用,且与浓度相关(见图3)。
Figure 3. The effect of LBP on vascular formation in rat aortic ring assay
图3. LBP对大鼠动脉环血管形成的影响
4.4. RT-PCR检测LBP对HDMEC内皮细胞BAI1表达的影响
LBP 500 μg/mL及1000 μg/mL处理HDMEC细胞48 h,检测BAI1 mRNA水平的变化,发现与肿瘤模型组比较,LBP给药后BAI1表达上调,且具有统计学意义(P < 0.05) (见图4)。
Figure 4. BAI1 expression of HDMEC cells after 48 h LBP treatment
图4. LBP处理HDMEC细胞48小时后,BAI1的表达*P < 0.05,**P < 0.01
5. 结论
恶性肿瘤侵袭与转移是肿瘤治疗失败的主要原因,血管形成为肿瘤细胞提供了丰富的氧及营养物质,为促进其转移等恶性生物学行为创造了条件 [7] 。抗血管生成药物通过切断恶性肿瘤细胞的养分补给,并阻断侵袭转移的血行通道,使肿瘤细胞静止于休眠状态,因此,以抑制肿瘤血管形成为目的的生物治疗受到广大研究者关注与青睐。
研究证实许多中药具有抗血管作用,例如 [8] 蜂毒素、去甲斑蝥素、蟾毒灵三种抗肿瘤中药对人体肝癌细胞HepG2细胞及人脐静脉内皮细胞ECV304细胞的生长均有不同程度抑制作用,在一定范围内呈浓度和时间的依赖性,鸡胚绒毛尿囊膜实验证实三种药物不同浓度均能抑制肿瘤血管形成(P < 0.01)。潘子民等 [9] 研究发现人参皂苷Rg3可通过下调肿瘤VEGF2mRNA及蛋白的表达量,阻滞肿瘤血管生成。这些传统中医药治疗肿瘤具有多靶点的特点,以及价格低廉,毒副作用小的优势,联合给药渴望减少靶向药物使用剂量,弥补靶向药物抗肿瘤血管治疗方面的缺陷,从而为肿瘤的治疗开辟更好的途径。
本课题前期实验结果表明LBP可抑制H22肝癌腹水移植瘤模型小鼠外周血VEGF的表达 [4] ,也发现LBP可抑制自发乳腺癌小鼠肿瘤间质血管形成 [2] 。本研究在体内实验中,采用CT26结直肠癌小鼠皮下移植瘤模型LBP整体给药,与对照组比较,又一次验证了LBP对小鼠结肠癌皮下移植瘤的生长具有一定的抑制作用(见图1),采用免疫组织化学检测发现肿瘤间质血管在给药后明显减少(见图2),通过大鼠动脉环实验我们进一步发现LBP对血管形成具有抑制作用(见图3),LBP在体外细胞培养实验发现对细胞没有明显的细胞毒作用,推测LBP在体内抑制血管形成可能是通过一些复杂的微环境及细胞因子分泌变化,间接干扰或抑制了内皮细胞的功能,进而影响了血管的形成。
脑组织特异性血管生成抑制因子1 (brain-specific angiogenesis inhibitor 1, BAI1)属于G蛋白偶联受体的B家族,是从人类脑组织中提取出来的一种抑癌基因。近年来研究证明人类肿瘤中BAI1表达水平与肿瘤的发生发展有着密切的关系,且具有抑制血管生成作用 [10] ,而在许多肿瘤组织中,BAI1的表达水平明显减低。BAI1抗血管的作用一般认为是与其膜外区域经蛋白酶水解产生的Vstat120和Vstat40片段有关,研究表明Vstat120和Vstat40可与内皮细胞上的CD36结合,进而发挥抗血管生成作用 [11] ,我们通过RT-PCR检测发现LBP可促进BAI1表达上调(见图4),因此认为LBP抑制小鼠结直肠癌肿瘤生长的作用可能与上调BAI1表达,间接抑制了血管形成有关,此方面的研究还有待进一步深入。由于LBP抗肿瘤作用具有多靶点的特征,其体内抑制肿瘤生长作用的机制还需要多方面深入探明。
基金项目
国家自然科学基金项目(No.81873154),广州中医药大学“高水平大学建设”项目(No.A1-AFD018171Z11003)。
NOTES
*通讯作者。