1. 引言
真菌毒素是真菌的次级代谢产物，普遍出现于受真菌污染的谷物、农作物中，从而对食品和饲料产生污染。真菌毒素可对动物和人类产生严重的健康威胁，国际癌症研究组织和世界卫生组织曾研究表明真菌毒素不仅可以引起人畜急性中毒、诱发癌症还会导致儿童发育迟缓，在全球范围内约有1.6亿五岁以下儿童因真菌毒素影响而发育不良。因此对于真菌毒素的防治和降解是全球性的课题，具有深远的意义和价值 [1]。
呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)，是由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌等镰刀菌产生的次级代谢产物，也是谷物中最常见的B型单端孢霉烯类毒素 [2]。呕吐毒素其结构为3α, 7α, 15一三羟基草镰孢霉-9-烯-8-酮，易溶于水、乙醇、乙酸乙酯等溶剂，在高温、高压以及酸性条件下非常稳定，具有较强的细胞毒性，免疫毒性和遗传毒性 [3] [4]。有研究表明对于以鸡为例的家禽来讲，日粮中呕吐毒素的摄入会严重影响家禽的饲料摄入、生长状态以及免疫系统功能 [5]，从而增加了家禽感染传染性疾病的可能性，影响其生产性能，对家禽养殖者造成巨大的经济损失 [6] [7]。此外，呕吐毒素对于一系列神经细胞也显示出明显的神经毒性。呕吐毒素可通过激活丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路诱导神经元细胞凋亡、影响神经递质的分泌、脂质过氧化和钙稳态，并增加了血脑屏障的通透性，从而产生神经毒性 [8]。对于人脑而言，已知研究表明呕吐毒素可以影响人脑中的多巴胺能受体，从而引起呕吐，腹泻，头痛和发烧等症状，对人体健康产生威胁 [9]。
当前对于呕吐毒素的脱毒方法主要可分为物理、化学和生物脱毒三个方法。物理方法和化学方法是当前呕吐毒素脱毒的主要方法，其中物理方法主要可分为热处理、漂白研磨、吸附、辐射处理等，化学脱毒法主要有强酸、强碱及臭氧处理等方法 [10]。虽然物理和化学脱毒方法在实际生产中具有应用面较广、价格低廉等优势，但是仍存在如降低农产品、饲料质量，降低食品营养价值及风味、有机物残留等缺点，限制了物理化学等脱毒方法在生产中的应用 [11]。生物脱毒具有反应条件温和、不使用有害化学试剂、对原料感官性状和适口性影响较小以及营养成分损失较少等优点，是当前食品、饲料处理过程中极具前景和潜力的呕吐毒素降毒方法，其主要机理可分为微生物菌体的吸附作用以及微生物的酶促降解作用 [12] [13]。其中微生物的酶促降解作用其机理主要有三种：1) C12、C13的开环氧化；2) 3C-OH的氧化、糖苷化或异构化作用；3) 水合作用 [14] [15]。有研究表明一些微生物可以利用呕吐毒素作为唯一碳源维持其生长，并通过以上三种机理将呕吐毒素转化为低毒甚至是无毒的产物，从而实现呕吐毒素脱毒的目的。因此脱毒菌株的筛选是当前呕吐毒素生物降解研究的关键和热点 [16]。
本文以从咖啡渣中筛选出了一株降解呕吐毒素的解单端孢菌素微杆菌XY-3，利用iELISA酶联免疫法测定了其对呕吐毒素的降解率，并对其生理生化特征进行了鉴定，为筛选新的呕吐毒素降解菌和在实际生产中呕吐毒素降解的应用提供了理论基础，具有一定的应用前景和价值。
2. 材料与仪器
2.1. 试验材料
LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，加水定容至1 L，121℃灭菌15 min。
LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，加水定容至1 L，121℃灭菌15 min。
筛选培养基：硫酸铵1 g，磷酸二氢钾3 g，磷酸氢二钾6 g，氯化钠0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.001 g，氯化钙0.05 g，玉米浆0.1 g，琼脂20 g，加水定容至1 L，121℃灭菌15 min。灭菌后，待稍冷却后加入经0.22 μm有机膜过滤后的苯基环氧乙烷至15 mmol/L作为唯一碳源，振荡分散均匀 [17]。
呕吐毒素标准品购于青岛普瑞邦生物工程有限公司；呕吐毒素iELisa呕吐毒素检测试剂盒购于北京中检维康生物技术有限公司；Lysis Buffee for Microogranism to Direct PCR试剂盒购买于北京宝日医生物技术有限公司；使用试剂均为分析纯。
2.2. 试验设备
SW-CJ-1FD超净工作台，购于苏州安泰空气技术有限公司；XLS-3750高压蒸汽灭菌锅，购于日本松下三洋公司；ZQLY-180F振荡培养箱，购于上海知楚仪器有限公司；LRH-250生化培养箱，购于上海一恒科技有限公司；3K15冷冻离心机，购于德国Sigma公司；SpectraMax Plus 384酶标仪，购于美国Bio-Rad公司；光学显微镜，购于日本Olympus公司。
3. 实验方法
3.1. 细菌的富集与分离
取5 g样品与45 ml的无菌水中，充分振荡混合后梯度稀释，取100 μl涂布于LB培养基，于37℃培养48 h。根据菌落形态及生长状况，挑去不同形态的单菌落在LB培养基中划线纯化，纯化后的菌株用50%甘油于−80℃中冷冻保存备用。
3.2. 呕吐毒素降解菌初筛
将纯化后的菌株接种于LB液体培养基中，37℃连续活化两代后，取1 ml菌液于2 ml离心管中，4℃，6000 xg离心10 min，去除上清液，用无菌水洗涤两次，梯度稀释。取100 μl不同稀释度的菌悬液涂布于筛选固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养，观察菌落生长状况。记录可在筛选培养基上生长的菌株，进行进一步筛选。
3.3. 呕吐毒素降解菌复筛
取初筛菌株于筛选培养基中37℃，180 r/min条件下培养24 h，发酵液于4℃，8000 xg条件下离心10 min，收集上清液，以苯基环氧乙烷为底物，利用酶标仪测定发酵上清液中的降解酶活力，筛选出降解活力最高的菌株
3.3.1. 苯基环氧乙烷标准曲线的测定
于1.5 ml的离心管中，加入135 μl磷酸盐缓冲溶液(pH = 8)与15 μl浓度分别为50、100、200、300、400、500 mmol/L的苯基环氧乙烷溶液，立即加入150 μl丙酮，充分振荡后依次加入三乙二醇二甲醚、三乙胺、230 mmol/L的4-(对硝基苄基)吡啶溶液各50 μl，混合震荡后取200 μl混合溶液于96孔板中，30℃保温90 min，分别测定在580 nm处的吸光值，绘制标准曲线。
3.3.2. 不同菌株降解酶活性的测定
于1.5 ml的离心管中，加入135 μl上清液与15 μl 200 mmol/L的苯基环氧乙烷溶液，30℃保温10 min后立即加入150 μl丙酮，充分振荡后依次加入三乙二醇二甲醚、三乙胺、230 mmol/L的4-(对硝基苄基)吡啶溶液各50 μl，混合震荡后取200 μl混合溶液于96孔板中，30℃保温90 min，分别测定在580 nm处的吸光值，以苯基环氧乙烷浓度为X轴，以相应吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将在30℃下，每分钟水解1 μmol苯基环氧乙烷所要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
3.4. 呕吐毒素降解率的测定
3.4.1. 呕吐毒素标准曲线的测定
根据iELisa呕吐毒素检测试剂盒说明书测定绘制呕吐毒素标准曲线，具体步骤如下：取50 μl呕吐毒素标准品于微孔中，依次加入50 μl的DON酶标抗原与50 μl DON抗体，震荡均匀避光于室温温育30 min，甩干孔液，加入250 μl洗涤液充分洗涤30 s，充分洗涤三次。洗涤完毕后在吸水纸上用力拍干孔液，加入150 μl底物，避光室温温育10 min后，每孔加入50 μl反应终止液，测定450 nm处的吸光值，以呕吐毒素标准品浓度值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线。
3.4.2. 呕吐毒素浓度降解率测定
以呕吐毒素纯品为底物，测定菌株呕吐毒素降解能力。挑取复筛菌株接种于50 ml的LB液体培养基中，37℃，180 r/min培养24 h，作为种子液。以2%的接种量再次接种于LB液体培养基中，相同培养条件培养24 h，作为发酵液。取990 μl发酵液于离心管中，加入10 μl浓度为100 μg/ml的呕吐毒素标准工作液，于37℃，180 r/min培养48 h，以LB液体培养基作为对照。48 h后将待检测液于10,000 xg离心5 min，取上清液经0.22 μm的无菌过滤器过滤后，用酶联免疫试剂盒测定上清液中呕吐毒素剩余含量，计算呕吐毒素降解率，测定方法与3.4.1相同。
3.5. 呕吐毒素降解菌的鉴定
将XY-3划线接种于LB培养基中，37℃培养24 h后观察菌株生长状态、色泽和菌落特征并进行革兰氏染色实验，按《伯杰氏细菌鉴定手册》说明，对XY-3进行形态学和生理生化鉴定 [18]。
3.6. 呕吐毒素降解菌的分子生物学鉴定
根据Buffee for Microogranism to Direct PCR试剂盒说明书要求，提取菌株基因组。使用细菌通用引物7F和1540R进行PCR扩增。扩增产物委托杭州擎科生物技术有限公司进行测序，所得序列利用Blast与GenBank数据库进行比对，并利用MEGA 7.0软件根据亲缘关系构建菌株进化树。
3.7. 统计分析
实验数据均使用SPSS 22.0软件进行单因素ANOVA分析，进一步利用Duncan检验进行组件显著性差异分析，p < 0.05表示具有显著性差异。
4. 结果与分析
4.1. 脱毒菌株的筛选
苯基环氧乙烷与呕吐毒素具有相同的C12、C13环氧结构，是低成本且有效的呕吐毒素脱毒菌株筛选方法之一。按照3.1的方法，从咖啡渣样品中筛选出来的菌株中，共筛选获得7株可在以苯基环氧乙烷为唯一碳源的初筛培养基中优势生长的菌株，分别编号为XY-1，XY-2，XY-3，XY-4，XY-5，XY-6，XY-7。通过测定这7株优势生长菌株对苯基环氧乙烷降解的酶活力，对这7株菌株进行复筛。从图1中可以看出，在7株菌株中，除XY-2外其余菌株上清液均能对苯基环氧乙烷有降解作用，其中XY-3与XY-5可以显著降低苯基环氧乙烷的含量，说明XY-3和XY-5极有可能产生具有降解呕吐毒素作用的胞外酶，并具有较强酶活性。
注：图中不同标记字母表示统计学结果显示差异显著。
Figure 1. Standard curve of styrene oxide (A) and determination its degradation rate (B)
图1. 苯基环氧乙烷标准曲线(A)及各菌株对其降解效果测定(B)
4.2. 呕吐毒素降解率测定
根据3.4的方法利用呕吐毒素酶联免疫试剂盒，对酶活性较强的5株菌(XY-1, XY-3, XY-4, XY-5, XY-6)，进行呕吐毒素降解率测定。由图2可得，这5株菌均对呕吐毒素具有降解作用，其中XY-3较其他菌株能显著降解培养基中的呕吐毒素，在24 h内其降解率达到27.71%，故取XY-3作为优势菌株进行进一步研究。
4.3. 脱毒菌株的鉴定
4.3.1. 菌株形态学特征
对XY-3进行菌落形态和革兰氏染色剪点，如图3(A)所示，XY-3在LB培养基中37℃培养24 h后，菌落形态呈圆形、金黄色不透明，表面凸起湿润光滑，边缘整齐。菌落革兰氏染色结果如图3(B)所示，经显微镜1000倍放大后观察可得XY-3为革兰氏阳性菌，在显微镜下菌体呈短杆状，无芽孢。
注：图中不同标记字母表示统计学结果显示差异显著。
Figure 2. Standard curve of DON (A) and determination its degradation rate (B)
图2. 呕吐毒素标准曲线(A)及各菌株对其降解效果测定(B)
Figure 3. Colony morphology (A) and Gram stain (B) of strain XY-3 (10 × 100)
图3. 菌株XY-3的菌落形态(A)及革兰氏染色(B) (10 × 100)
4.3.2. 菌株16S rDNA鉴定
使用Lysis Buffee for Microogranism to Direct PCR试剂盒提取XY-3基因组，并对其进行PCR扩增。将扩增产物进行基因组测序，将测序结果于NCBI中进行BLAST比对，并通过MEGA软件构建XY-3亲缘进化树。比对结果如图4亲缘关系进化树所示，XY-3与KF953537.1 Microbacterium trichothecenolyticum strain M03 L05 (解单端孢菌素微杆菌)亲缘关系最近，结合其菌落形态特征和DNA同源性比对结果，将XY-3确认为解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)。
4.3.3. 菌株生理生化特征
对XY-3进行部分生理生化特性鉴定，包括生长实验及化学敏感性实验，实验结果如表1、表2、表3所示，结果表明XY-3可分泌接触酶和β-半乳糖醛酸酶，并能利用如a-D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖、蔗糖、D-麦芽糖等多种碳源促进生长。同时XY-3具有较强的耐盐能力，对多种抗生素如利福霉素SV、氨曲南、萘啶酸等不敏感，但在pH为5.0以及盐酸胍、十四烷硫酸钠、夫西地酸存在的条件下较为敏感，无法生长。
Figure 4. Phylogenetic tree of strain XY-3 based on 16SrDNA
图4. 菌株XY-3基于16SrDNA的系统进化树
Table 1. Basic physiological and biochemical identification of strain XY-3
表1. XY-3生理生化鉴定
Table 2. Carbon source analysis and identification of strain XY-3
表2. XY-3碳源分析鉴定
Table 3. Sensitivity test of strain XY-3
表3. XY-3敏感性鉴定
5. 结论
本研究通过呕吐毒素类似物从咖啡渣中筛选出7株具有降解呕吐毒素潜力的菌株，并对前5株优势菌株进行呕吐毒素降解率测定。在含有呕吐毒素的培养基中培养后，通过iElisa酶联免疫试剂盒最终筛选出一株具有较高呕吐毒素降解率的菌株XY-3，在24 h内其降解率为27.71%。经分子生物学鉴定，该菌株被鉴定为解单端孢菌素微杆菌(Microbacterium trichothecenolyticum)，并通过一系列生理生化鉴定，初步了解了XY-3的生长特性和化学敏感性。上述研究为呕吐毒素降解菌株的筛选提供了理论基础，并进一步拓展了微生物在呕吐毒素降解中的应用前景，为后续的研究提供了基础和参考。
NOTES
*通讯作者。