1. 引言
卵黄蛋白原是一种普遍存在于卵生非哺乳动物血液中的雌性特异性蛋白，是几乎所有卵生动物中卵黄磷蛋白的前体 [1]。在中华绒螯蟹中卵黄蛋白原主要是作为载体蛋白进入卵母细胞，合成卵黄磷蛋白为卵巢发育提供必需营养物质，同时也是卵的主要成分，为后续胚胎发育提供必要的能量 [2]。由于中华绒螯蟹的卵黄发生的调控过程受内分泌系统、营养条件和环境因子多重调节 [3]，而卵巢中卵黄积累的多少直接影响到其后生殖过程和幼体质量 [4]，因此深入研究卵黄发生的调控机制对于中华绒螯蟹的人工繁殖具有重要的现实意义。免疫组化技术是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性的方法，具有特异性强、灵敏度高和易重复等优点，被广泛用于甲壳动物卵黄磷蛋白的组织学定位 [5] [6]。由于不同甲壳动物卵黄磷蛋白的亚基数目、空间结构存在差异，必须制备特异性抗体，才能保证免疫组化实验结果准确，此外，现有对于中华绒螯蟹卵黄磷蛋白免疫组化的研究均集中与其合成位点(肝胰腺)和沉积部位(卵巢)，且均基于多克隆抗体进行免疫识别。对于胚胎发育期间卵黄磷蛋白空间分布尚无报道，本研究通过纯化中华绒螯蟹卵黄磷蛋白，随后制备单克隆抗体，建立了中华绒螯蟹卵黄磷蛋白免疫组化方法，为后续中华绒螯蟹卵黄发生机制及胚胎发育生物学打下基础。
2. 材料和方法
2.1. 样品采集
实验用中华绒螯蟹于2018年12月取自上海海洋大学崇明基地成蟹养殖池塘，挑选活力良，肢体健全个体用于样品采集，采样前对蟹进行称重，随后迅速解剖出卵巢并进行称重，计算性腺指数，随后置于−80℃冰箱中保藏，挑选性腺指数10以上个体的样品用于进一步的蛋白纯化。
2.2. 试剂配制
参考《基因工程试验指南》中聚丙烯酰胺变性凝胶电泳相关实验方法配制所需试剂，具体配方如下。
匀浆缓冲液：IM Tris-HCl (pH = 7.6) 10 ml、NaCl 2.925 g、EDTA：0.05 g和100mM PMSF 0.5 ml用蒸馏水定容至500 ml；
PBS缓冲液：KH2PO4 0.1 g、Na2HPO4·12H2O 1.45 g、NaCl 4.0 g和KCl 0.1 g用蒸馏水定容至500 ml；
丙烯酰胺单体贮液：14.55 g丙烯酰胺加上0.45 g N，N'-甲叉双丙烯酰胺，先用40 mL双蒸水搅拌溶解，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀至50 mL，过滤。用棕色瓶4℃保存备用。
浓缩胶缓冲液贮液(0.5 mol/L Tris-HCl，pH6.8)：3.03 g Tris溶解在40 mL双蒸水中，用4 mol/L盐酸调pH6.8。再用双蒸水稀至50 mL。保存在4℃备用。
分离胶缓冲液贮液(1.5 mol/L Tris-HCl，pH8.9)：18.16 g Tris溶解在80 mL双蒸水中，用4 mol/L盐酸调pH8.9。再用双蒸水稀至100 mL，保存在4℃备用。
10% (AP)过硫酸铵：0.1 g过硫酸铵溶入1.0 mL双蒸水，使用前新鲜配制。
电极缓冲液(0.025 mol/L Tris，0.2 mol/L甘氨酸，pH8.3)：15.14 g Tris加上72.07 g甘氨酸，用双蒸水稀释到5 L。可在室温保存一个月。
样品缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl，pH6.8)：2 ml浓缩胶缓冲液贮液加上1 mL 87%甘油、0.1 mg溴酚蓝，用双蒸水稀释至10 mL，可在-20℃保存6个月。
分离胶配方双蒸水：6.6 ml、30%丙烯酰胺溶液：8.0 ml、1.5 mol/L Tris (pH8.8)： 5.0 ml、10% AP (W/V)：200 ul、TEMED：15 ul。
浓缩胶配方：双蒸水：6.8 ml、30%丙烯酰胺溶液：1.7 ml、1 mol/L Tris (pH6.8)：1.25 ml、10%过硫酸铵(W/V)：100 ul、TEMED：10 ul [7]。
2.3. 蛋白分离
蛋白初分离参考江洪波(2003)研究方法，取5.0 g左右中华绒螯蟹的成熟卵巢，加入10 ml预冷的匀浆缓冲液，用手持式分散机充分冰浴匀浆，然后将匀浆液在4℃下12，000转离心30分钟，取紫色上清液3~5 ml，并加入等体积的饱和硫酸铵溶液，冰浴2 h后在4℃下12000转离心30分钟，弃上清液，向离心管中加入5 ml的PBS缓冲液溶解沉淀，重复以上步骤3次，最后用5 ml PBS缓冲液溶解沉淀，用于蛋白纯化 [8]。
采用伯乐全自动蛋白质和多肽的纯化仪(型号：BioLogic DouFlowTM，美国伯乐公司生产)对卵巢提取物进行分离纯化．其中凝胶柱体积为120 ml，装入30 ml凝胶，纯化前首先采用PBS溶液平衡凝胶柱，流速3 mL/min，平衡3小时。用注射器上样蛋白提取液(蛋白浓度约为l mg/ml)，流速为0.6 ml，在280 nm和470 nm条件下检测洗脱液的吸光度(OD)，当出现蛋白组分时每lmL收集一次。洗脱液于−70摄氏度保存备用。
2.4. 蛋白纯化
将玻璃板、胶垫、梳子用双蒸水洗干净，用酒精棉球擦拭，将电泳槽安装好，配制分离胶(12%)和浓缩胶(5%)。过硫酸铵和TEMED最后加入，加入后聚合即开始，应立即混匀倒入两块玻璃板之间。分离胶倒入两块玻璃板间，应该留下适合的高度，使点样孔前端离分离胶有2.5 cm左右的距离，在胶顶部缓缓加入约0.5 cm高的双蒸水，待分离胶聚合完全后，倾去上层的双蒸水，用双蒸水清洗凝胶顶层，用吸水纸吸去残余的水滴。将浓缩胶倒入玻璃板夹层，插上梳子，待浓缩胶聚合完全后，拔去梳子，立即用双蒸水清洗点样孔，加入电极缓冲液 [7]。
将中华绒螯蟹卵黄磷蛋白洗脱液经PBS稀释为浓度20 ug/ul后与上样缓冲液4:1混合，用微量进样器点入点样孔底部，200伏电泳。当溴酚蓝到达分离胶时，电压改为250伏，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。将凝胶剥下，浸泡在100 ml的底物液中，染色1小时，待胶带显色后立即照相。然后将凝胶进行染色，中华绒螯蟹卵黄磷蛋白共有两个亚基条带，分别为70和100 kD，对条带进行割胶回收蛋白。
2.5. 动物免疫
初免抗原为蛋白与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化。二免、三免、四免抗原为蛋白与等体积弗氏不完全佐剂混匀乳化。五免冲击为蛋白与等体积生理盐水混合，冲击免疫。选用健康Blbc小鼠，6~8周龄。一免：第1天，免疫用抗原为弗氏完全佐剂+蛋白；二免：第14天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白；三免：第28天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白；四免：第42天，免疫用抗原为弗氏不完全佐剂+蛋白；四免后采血：第49天，尾根静脉采血10 ul，ELISA检测抗血清效价；五免：第56天，免疫用抗原为生理盐水+蛋白。五免冲击后5天，取小鼠脾脏，研磨后与SP2/0进行细胞融合，并铺板。
2.6. 亚克隆筛选及建立细胞株
融合后14~16天，镜检观察细胞，取上清elisa检测。阳性孔细胞转孔，并有限稀释，进入第一轮亚克隆筛选。6~7天后，镜检观察细胞，取上清elisa检测。阳性孔细胞转孔，并有限稀释，进入第二轮亚克隆筛选。5~6天后，镜检观察细胞，取上清elisa检测。阳性孔细胞转孔，并有限稀释，进入第三轮亚克隆筛选。第三轮亚克隆筛选后，elisa检测阳性细胞株，扩大培养，90%铺满培养皿后，取少量接入T25瓶中，剩余细胞收集并冻存。
2.7. 腹水制备
提前1周给小鼠腹腔注射矿物油。T25瓶中细胞培养至90%铺满，收集细胞，注射入小鼠腹腔。8~20天内观察小鼠腹腔，鼓胀到行动受限时，收集腹水。腹水离心并过滤后，用等体积PBS稀释，ProteinAG纯化，收集抗体。
2.8. 抗体效价检测
将抗原用0.05m ol/L碳酸盐(PH = 9.6)稀释至3 ug/ml，100 ul/孔，4℃孵育过夜。取出用0.05% Tween-20 (PBST)洗涤三次，3分钟/次。每孔加入5%脱脂奶粉(PBST) 150 μl封闭液，37℃封闭120分钟。取出用0.05% Tween-20 (PBST)洗涤三次，3分钟/次。将抗体分别按照1:1000稀释，然后倍比稀释，至1:512K，37℃孵育1小时。取出用5% Tween-20 (PBST)洗涤三次，3分钟/次。加辣根酶标记山羊抗兔IgG (H+L)。1:8000稀释，37℃孵育45分钟。取出用0.05% Tween-20 (PBST)洗涤五次，3分钟/次。加入底物溶液(TMB) 100 μl/孔，反应5~10分钟，最后加入100 μl 2 mol/L硫酸终止反应。用酶标仪在450 nm波长下测定OD值。
2.9. 免疫组化验证
选取中华绒螯蟹囊胚期、原肠期、卵内无节幼体期胚胎和大眼幼体作为实验材料，验证制备的抗体的特异性，胚胎经波恩液固定24小时后，转移至70%的酒精保存，随后经过梯度脱水，浸蜡(56℃~58℃)，包埋后进行切片，切片厚度为5~7 μm。(神经组织先经过2%琼脂预包埋其他处理步骤相同)，切片经过脱蜡水化后，进行抗原热修复10分钟(修复液为枸橼酸修复液Ph6.0)，随后滴加0.3%双氧水用于封闭内源性过氧化物酶活性10分钟，PBST漂洗三次，每次2分钟，滴加鼠抗中华绒螯蟹卵黄磷蛋白，稀释比例为1:200，湿盒中4℃过夜，PBST漂洗三次，每次2分钟，滴加二抗(抗鼠IgG-hrp)，湿盒中37℃孵育1小时，PBST漂洗三次，每次2分钟，DAB显色后封片，随后拍照。
3. 结果
3.1. 抗体效价检测
抗体效价Elisa检测数据见表1，其中血清效价值 ≥ 2.5 × 阴性值。由表一可知，三株小鼠抗中华绒螯蟹卵黄蛋白原抗体效价：2N17 ≥ 64 K，3G2 ≥ 64 K，2J11 ≥ 64，抗体浓度检测可知，2N17：0.8 mg/ml，3G2：0.8 mg/ml，2J11：0.7 mg/ml。
Table 1. Antibody titer test of ELISA data
表1. 抗体效价检测ELISA检测数据
3.2. 免疫组化验证
卵黄磷蛋白在甲壳动物中可作为载体蛋白进入卵母细胞，为胚胎和早期幼体提供必须的营养物质。因此可以通过免疫组化技术对中华绒螯蟹卵黄磷蛋白在其胚胎和幼体中进行定位，结果见图1，胚胎发育在囊胚期和原肠期时，卵黄磷蛋白强阳性位点均分布于卵黄物质中，聚集与卵黄岛周边(图1(a)，图1(b)箭头)，当胚胎发育至卵内无节幼体期，卵黄囊中阳性物质变弱，数量变少(图1(c)箭头)，发育至心跳期时(图1(d)箭头)，卵黄囊中已无卵黄磷蛋白阳性物质变弱，仅仅分布于卵黄囊外周，围绕肝胰腺前体细胞有弱阳性位点(图1(d)箭头)，随后胚胎孵化，卵黄磷蛋白阳性位点消失，蚤状幼体和大眼幼体的肝胰腺区域均无发现(图1(e)箭头)，暗示中华绒螯蟹在胚胎发育中期是卵黄磷蛋白动用高峰，而末期卵黄磷蛋白已消耗殆尽，初孵幼体已不带有卵黄磷蛋白。
(a) 中华绒螯蟹囊胚期胚胎中卵黄磷蛋白定位(黑色箭头)；(b) 中华绒螯蟹原肠胚期胚胎中卵黄磷蛋白定位(黑色箭头)；(c) 中华绒螯蟹无节幼体期胚胎中卵黄磷蛋白定位(黑色箭头)；(d) 中华绒螯蟹心跳期胚胎中卵黄磷蛋白定位(黑色箭头)；(e) 中华绒螯蟹大眼幼体中卵黄磷蛋白定位(无阳性物质)；(f) 阴性对照
Figure 1. IHC identification of vitellophosphoprotein in embryo and larval of Eriocheir sinensis
图1. 中华绒螯蟹胚胎及幼体中卵黄磷蛋白免疫组化识别
4. 讨论
甲壳动物卵黄磷蛋的分子量在280 kDa左右，有2~4个亚基组成，通过SDS-PAGE分析确定Vg中亚基的数量和大小在不同物种间有所差异，以常见的经济甲壳动物为例，三疣梭子蟹卵黄磷蛋白拥有三个亚基100，75和66 kD)，分子量287 kD [9]，罗氏沼虾卵黄磷蛋白拥有两个亚基(97和95 kD)，分子量286 kD [10]，斑节对虾卵黄磷蛋白拥有两个亚基(170和82 kD) [11]，分子量284 kD。本研究中，中华绒螯蟹卵黄磷蛋白拥有70和100 kD两个亚基，与先前的研究基本一致 [8]。由于卵黄磷蛋白是十足目甲壳动物整个卵巢发育周期中储存营养物质的主要形式，同时产卵后继续为胚胎发育提供氨基酸、脂类、碳水化台物和维生素等各类营养素，先前较多的研究均关注与甲壳动物卵黄磷蛋白Elisa方法的建立 [8] [9]，此外，原有我国两大经济蟹类的卵黄磷蛋白研究的免疫学手段均是基于多克隆抗体制备技术，与之相比，本研究中的卵黄磷蛋白单克隆抗体在实际应用中特异性更强，而本研究则进一步将卵黄磷蛋白单克隆抗体应用于免疫组化研究，也验证了卵黄磷蛋白在胚胎过程中是所起的重要作用，对于研究卵黄磷蛋白在甲壳动物各器官或胚胎中的时空分布提供了有力支撑。
基金项目
上海市自然科学基金项目《中华绒螯蟹胚胎发育过程中卵黄物质动用机制及其幼体肝胰腺发育模型构建》(18zr1434300)。
NOTES
*通讯作者。