绝经后T2DM女性OPG基因rs2073618、rs3102735位点多态性与骨代谢的关系

Relationship between rs2073618 and rs3102735 Polymorphisms of OPG Gene and Bone Metabolism in Postmenopausal Women with T2DM

摘要: 目的：探讨骨保护素(osteoprotegerin, OPG)基因rs2073618、rs3102735位点多态性及突变与绝经后2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)女性骨代谢的关系，为后续治疗提供依据。方法：1) 选取石河子地区研究对象200例，所有研究对象均为绝经后女性，根据骨密度(Bone mineral density, BMD)分为：正常对照组(A组)、单纯骨量异常组(B组)，根据不同的糖耐量水平分为：单纯T2DM (C组)、T2DM伴骨量异常组(D组)。2) 测定骨、糖、脂、糖化血红蛋白(Glycated hemoglobin, HbA1c)、BMD (L1-4) 及BMD (股骨颈)等相关指标。3) 运用Mass ARRAY质谱仪检测OPG基因位点多态性。4) 多组间计量资料采用方差分析；BMD影响因素采用多元线性回归分析。结果：1) 与A组相比，C组、D组的空腹血糖(FPG)及HbAlc水平升高；D组、B组BMD (L1-4)及BMD (股骨颈)水平降低，(P < 0.05)。2) 在D组中，rs2073618位点突变型(GG/GC型)的Ca高于野生型(CC型)、rs3102735位点突变型(CC/TC型)的Ca低于野生型(TT型)；在C组中，rs2073618位点突变型(GG/GC型)的BMD (1-4)高于野生型(CC型)，P < 0.05。3) 多元线性回归分析：身体质量指数(BMI)、甘油三酯(TG)的升高是(BMD) L1-4增高的保护因素，绝经年限增高是其危险因素。高密度脂蛋白(HDL-C)升高是股骨颈骨密度增高的保护因素，绝经年限增高是其危险因素。结论：OPG基因rs2073618、rs3102735位点基因多态性与石河子地区绝经后T2DM女性合并骨质疏松(osteoporosis, OP)无关，但该两位点基因突变和绝经后T2DM女性并发OP的发生有关。

Abstract: Objective: To investigate the relationship between rs2073618 and rs3102735 polymorphism and mutation of osteoprotegerin (OPG) gene and bone metabolism in postmenopausal women with Type 2 diabetes mellitus (T2DM), so as to provide evidence for follow-up treatment. Methods: 1) A total of 200 subjects were selected from Shihezi area, all of which were postmenopausal women. According to Bone mineral density (BMD), the subjects were divided into normal control group (group A) and simple abnormal bone mass group (group B), and according to different glucose tolerance levels, they were divided into: simple T2DM (group C) and T2DM with abnormal bone mass (group D). 2) Measurement of bone, sugar, lipid, Glycated hemoglobin (HbA1c), BMD (L1-4), and BMD (neck of femur), respectively. 3) The polymorphism of OPG gene locus was detected by Mass ARRAY mass spectrometer. 4) Analysis of variance was used for measurement data among multiple groups; the influencing factors of BMD were analyzed by multiple linear regression. Results: 1) Compared with group A, fasting blood glucose (FPG) and HbAlc levels in groups C and D were increased. BMD (L1-4) and BMD (neck of femur) levels in groups D and B were decreased (P < 0.05). 2) In group D, Ca of rs2073618 mutant (GG/GC) was higher than that of wild type (CC), and Ca of rs3102735 mutant (CC/TC) was lower than that of wild type (TT). In group C, BMD (1-4) of rs2073618 mutant (GG/GC type) was higher than that of wild type (CC type), P < 0.05. 3) Multiple linear regression analysis: the increase of body mass index (BMI) and triglyceride (TG) is the protective factor for the increase of L1-4 (BMD), and the increase of menopause years is the risk factor. Elevated high density lipopro-tein (HDL-C) is a protective factor for increased bone density of femoral neck, and the increase of menopause years is a risk factor. Conclusion: rs2073618 and rs3102735 polymorphisms of OPG gene are not associated with menopausal T2DM women with OP, but the mutations of these two sites are associated with OP in postmenopausal T2DM women in Shihezi.

1. 引言

糖尿病是一种复杂的代谢性疾病，是全球发病率增长最快的疾病，以2型糖尿病居多 [1] 。骨质疏松是糖尿病较为常见的并发症。据相关研究表明，T2DM女性骨密度异常及骨质疏松骨折的发生率增加 [2] 。OPG是由成骨细胞产生的一种肿瘤坏死细胞受体，通过抑制破骨形成来增加骨量 [3] 。OPG基因位于8号染色体(8q24)，其中最重要的是位于启动子区域的T245G (rs 3134069)，位于5'非翻译区域的T950C (rs 2073617)，以及位于外显子i的G1181C (rs 2073618) [4] 。Blaščáková MM [5] 等人关于绝经后斯洛伐克女性的研究表明，OPG基因的表达及其位点与BMD有关。一项来自印度的研究结果表明，OPG基因rs2073617与BMD没有关联 [6] 。Guo等 [7] 人发现OPG2073618是骨密度的预测因子，且与发生骨质疏松症的风险密切相关。在女性人群中OPG rs3102735与脊柱骨密度相关，与股骨颈骨密度无相关性 [8] 。已有大量报道研究OPG基因在T2DM及OP中的作用，但OPG基因在绝经后T2DM女性中的报道罕见。因此我们通过对OPG基因中的rs2073618和rs3102735进行研究，进一步明确OPG基因多态性与绝经后T2DM女性糖、脂、骨代谢指标的关系。

2. 材料和方法

2.1. 一般资料

以2020年9月至2021年9月来石河子大学医学院第一附属医院住院及门诊女性为研究对象，根据骨密度(Bone mineral density, BMD)分为：正常对照组(A组) 52例、单纯骨量异常组(B组) 43例，根据糖尿病病史、口服葡萄糖耐量试验(OGTT)分为：单纯T2DM (C组) 47例、T2DM伴骨量异常组(D组) 58例。排除其他类型糖尿病、其他骨代谢疾病及使用影响骨代谢药物者。所有患者均知情并签署同意书。

2.2. 方法

1) 收集研究对象的年龄、身高、体重、腰围等基线资料，计算BMI和腰臀比(waist hip ratio, WHR)；采用罗氏Cobas6000自动生化分析仪测定FPG、TG、血Ca、血P等生化指标。

2) 骨密度的测定：双能X线吸收仪(DEXA)测定骨密度(腰椎、股骨颈)。

3) DNA分离：禁食8小时后抽取研究对象静脉血5 ml，使用DNA试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取DNA并于−80℃冰箱保存。

4) 基因的测序：采用Sequenom_SNP测定OPGrs2073618、rs3102735位点的基因多态性。

2.3. 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计分析，数据呈正态分布，采用 $\bar{x}$ ± s表示。多组间比较采用协方差分析，基因型及基因位点的组间比较采用χ²检验。多元线性回归分析影响T2DM患者BMD的因素。当P < 0.05差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 一般临床资料比较

与A组相比，B组绝经年限较高、BMI较低(P < 0.05)，年龄、WHR差异无统计学意义(P > 0.05)；D组年龄、绝经年限较高(P < 0.05)，BMI、WHR差异无统计学意义(P > 0.05)；C在在年龄、绝经年限、BMI、WHR差异均无统计学意义(P > 0.05)；各生化指标采用协方差分析(见表1)。

Table 1. Comparison of general clinical data ( $\bar{x}\pm s$ )

表1. 一般临床资料比较( $\bar{x}\pm s$ )

注：与A组相比，^*P < 0.05。

3.2. 各生化指标及骨密度比较

与A组相比，B组的BMD (L1-4)、BMD (股骨颈)降低[(0.93 ± 0.12) g/m² vs (1.16 ± 0.20) g/m², (0.78 ± 0.13) g/m² vs (1.02 ± 0.25) g/m² (P < 0.05)]；C组的FPG、HbA1c、HDL-C升高[(9.10 ± 2.44) mmol/L vs (5.00 ± 0.589) mmol/L, (8.42 ± 1.95) mmol/L vs (6.01 ± 0.83) mmol/L, (1.93 ± 1.06) mmol/L vs (1.43 ± 0.49) mmol/L, (P < 0.05)]；D组的FPG、HbA1c升高[(8.57 ± 2.56) mmol/L vs (8.19 ± 1.87) mmol/L, (P < 0.05)]；D组的BMD (L1-4)、BMD (股骨颈)降低[(0.95 ± 0.10) g/m² vs (1.16 ± 0.20) g/m², (0.77 ± 0.10) g/m² vs (1.02 ± 0.25) g/m² (P < 0.05)]，余无统计学差异(P > 0.05) (见表2)。

Table 2. Comparison of biochemical indexes and bone mineral density ( $\bar{x}\pm s$ )

表2. 各生化指标及骨密度比较( $\bar{x}\pm s$ )

注：与A组相比，^*P < 0.05。

3.3. 各组患者OPG基因rs2073618、rs3102735位点基因型分布频率比较

研究结果显示，在OPG基因rs2073618、rs3102735位点基因型分布差异无统计学意义(P > 0.05) (见表3)。

Table 3. Comparison of genotype distribution frequencies at rs2073618 and rs3102735 sites of OPG gene in patients of all groups [n (%)]

表3. 各组患者OPG基因rs2073618、rs3102735位点基因型分布频率比较[n (%)]

注：P1：B组与A组相比；P2：C组与A组相比；P3：D组与A组相比。

3.4. 四组间OPG基因不同位点基因型间骨代谢指标及BMD的比较

由于研究位点突变基因型的样本量较少，故将GC、GG合并，TC、TT合并分别与CC、TT比较。D组，rs2073618位点，与野生型(CC)相比，突变型(GG/GC) Ca、BMD (L1-4)升高[2.32 ± 0.33 vs 2.25 ± 0.03、0.97 ± 0.03 vs 0.93 ± 0.01, (P < 0.05)]；C组和D组，rs3102735位点，与野生型(TT)相比，突变型(CC/TC) Ca降低[2.15 ± 0.05 vs 2.31 ± 0.03、2.18 ± 0.04 vs 1.15 ± 0.04 (P < 0.05)]，余指标差异无统计学意义(P > 0.05) (见表4)。A组和B组组间比较无统计学差异(P > 0.05)。

Table 4. Inter-group comparison of bone metabolism indexes at different loci of OPG gene and different genotypes ( $\bar{x}\pm s$ )

表4. OPG基因不同位点和不同基因型骨代谢指标的组间比较( $\bar{x}\pm s$ )

注：与CC (野生型)相比^*P < 0.05，与TT (野生型)相比^*P < 0.05。

3.5. BMD与各指标的多元线性回归分析

影响BMD的危险因素分析将BMD作为因变量，以影响BMD变化相关因素作为自变量，通过多元线性回归分析显示，BMI、TG与BMD (L1-4)呈正相关，HDL-C与BMD (股骨颈)呈正相关；绝经年限与BMD (L1-4)、BMD (股骨颈)呈负相关(见表5)。

Table 5. Multiple linear regression analysis of BMD and each index

表5. BMD与各指标的多元线性回归分析

注：^*P < 0.05；^**P < 0.01。

4. 讨论

OP是一种因骨矿物质密度低而导致骨骼对骨折的易感性增加为特征的疾病 [9] 。绝经后女性由于体内激素水平改变，OP发生风险增加 [10] 。T2DM患者因血糖升高使BMD降低，导致骨脆性增加，骨折发生率增加 [11] ，这表明T2DM患者发生了特定的骨代谢改变。研究发现，OPG是一种可溶性核因子-B配体受体激活剂(RANKL)诱骗受体，主要由成骨细胞产生，RANKL与其受体RANK结合，刺激破骨细胞成熟和分化，OPG可抑制RANKL和RANK受体结合进而阻止破骨细胞的形成和破骨细胞骨吸收 [3] [12] ，延缓了骨质破坏的进程，从而减慢骨吸收的进程。目前关于OPG基因与T2DM及OPG基因与OP关系的研究已有大量的研究 [13] [14] ，而关于OPG基因多态性与T2DM合并OP的相关性研究尚不多见，因此探讨OPG基因位点多态性与T2DM、OP的相关性，从而深入了解遗传多态性与T2DM合并OP的发病机制，从而为临床早期防治糖尿病和骨质疏松症提供新思路。

本研究结果显示，与A组相比，OPGrs2073618位点、rs3102735位点的基因多态性在B组、C组、D组间差异无统计学意义，与TaoSun [15] 等人研究的原发性绝经后骨质疏松症患者和健康对照组的等位基因和基因型频率分布存在显著差异结果相反，考虑其原因可能种族差异、纳入样本量大小、人群纳入标准不同有关。另外，OP是一种多基因遗传的疾病，其基因突变在BMD损失中起重要作用 [16] 。本研究中，T2DM伴骨量异常组，OPG基因rs2073618位点突变型基因组Ca、BMD (L1-4)高于野生型基因组，提示该位点基因突变能使骨强度增加，减少骨质破坏，这与Nair S [6] 等人关于OPG及RANK基因多态性与BMD关系的研究结果相符。Xiaoyong Sheng [17] 等观察到OPG基因rs2073618位点的突变可能导致BMD降低甚至骨质疏松性骨折，与我们的研究结果相反。造成此结果的原因首先我们仅观察了rs2073618位点突变，周围还有其他基因位点的突变，其次病例组和对照组的样本量较小，仅限于西北地区人群。因此，我们需要继续扩大样本量，进一步研究细胞水平和体内的机制。OPG基因rs3102735位点突变型基因组Ca低于野生型。这与Song等 [18] 的研究相符。以上结果提示OPG基因突变对绝经后女性的OP及BMD可能有影响。

本研究多元线性回归分析显示，绝经年限与BMD (L1-4)和BMD (股骨颈)呈负相关，绝经年限的增加与OP患病率呈正相关，这与卜淑敏 [19] 等的研究结果一致，这可能与绝经后女性雌激素的水平下降有关 [10] 。BMI的增加是是BMD (L1-4)的保护因素，这与Song J [20] 等研究结果一致，说明一定程度的BMI的增加，可以减慢OP的发生。HDL-C的升高是BMD (股骨颈)的保护因素，随着HDL-C的升高，BMD升高，这与Zolfaroli I [21] 等的结论是一致的，而Niu P [22] 等人的研究证明血液中HDL-C水平升高与BMD的降低有关，但也有些研究并未发现两者有明确关系 [23] 。这种不一致的结果可能是由于不同的人群选择，不同的研究设计和流行病学研究的固有缺陷。此外，血脂结果的差异也可能来自不同研究人员的分析方法。

5. 总结

综上所述，OPG基因rs2073618、rs3102735位点基因多态性与绝经后T2DM女性OP的发生无关，但该两位点的基因突变参与了绝经后T2DM女性OP的发生，可能成为识别T2DM女性发生OP的潜在诊断标志物。基于以上我们的研究结果，将有助于从基因水平为绝经后T2DM女性OP的防治提供依据。

基金项目

国际科技合作推进计划：FOSL2通过TGF-β1/Smad3信号通路在T2DM中作用及机制的研究(GJHZ202206)。

参考文献

NOTES

^*通讯作者。