DNA甲基化对急性髓系白血病作用的研究进展

Research Trends on the Impact of DNA Methylation on Acute Myeloid Leukemia

摘要: 研究证实，在基因的表观遗传调控中DNA甲基化起着至关重要的作用。而DNA甲基转移酶(DNMT)催化DNA甲基化，这是DNA甲基化模式形成和保持的必要条件。在哺乳动物细胞中，有三种关键的DNMT负责着不同的任务。首先是DNMT1，负责维持DNA的甲基化状态，保持细胞功能正常运转。而另外两种则是DNMT3a和DNMT3b，它们则负责推动DNA从头开始的甲基化过程。目前，急性髓系白血病(AML)的病因仍无法完全阐明。通过研究发现，异常的表观遗传学变化与AML的发病密切相关。深入探讨DNA甲基化与AML之间的联系，将为治疗这种疾病和开发新药物提供关键的分子靶点。这一领域的突破将为医学界带来新的希望，为患者提供更有效的治疗方案。

Abstract: Research has confirmed that DNA methylation plays a crucial role in the epigenetic regulation of genes. DNA methyltransferase (DNMT) catalyzes DNA methylation, which is a necessary condition for the formation and maintenance of DNA methylation patterns. In mammalian cells, there are three key DNMTs responsible for different tasks. Firstly, DNMT1 is responsible for maintaining the methylation status of DNA and ensuring the normal functioning of cells. The other two are DNMT3a and DNMT3b, which are responsible for driving the DNA methylation process from scratch. At present, the etiology of acute myeloid leukemia (AML) cannot be fully elucidated. Through research, it has been found that abnormal epigenetic changes are closely related to the onset of AML. Exploring the relationship between DNA methylation and AML in depth will provide key molecular targets for the treatment of this disease and the development of new drugs. Breakthroughs in this field will bring new hope to the medical community and provide more effective treatment options for patients.

1. 引言

急性髓系白血病(AML)是一种临床和遗传异质性疾病，预后不良，这种疾病可以浸润骨髓、血液和其他组织，临床进展迅速，其特点为高复发率及高死亡率。目前，对于AML患者来说，一般采用“3 + 7”的标准诱导方案，即蒽环类或蒽二酮类药物和阿糖胞苷结合起来进行的强化化疗，缓解后再进行几个疗程的巩固化疗或造血干细胞移植[1]。但其存活率低，大多数AML患者存在复发的可能性，甚至部分患者无法获得完全缓解[2]。表观遗传学被定义为研究基因表达的可遗传变化，而与原代DNA序列的改变无关。为了调节分裂和非分裂细胞中的基因表达，各种表观遗传修饰，如多梳组(PcG)蛋白对组蛋白尾部的修饰、核小体重塑、DNA甲基化、非编码RNA (ncRNA)通过表达的转录对数量和类型的变化进行调节起着非常关键的作用，这些修饰主要调节细胞增殖分化和各种疾病进展[3]。其中，DNA甲基化最为常见，其异常与肿瘤的发展密不可分。据说，DNA低甲基化会导致癌症相关基因过度表达，而DNA高甲基化则可沉默抑癌基因的表达，这都会干扰细胞生长或者影响抗癌治疗效果。因此，了解异常DNMT的分子作用将为临床研究和新药开发奠定理论基础。

2. DNA甲基化与甲基化转移酶

通常，DNA甲基化是由称为DNA甲基转移酶(DNMT)的蛋白质家族执行的，该蛋白质家族在哺乳动物中，包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT催化胞嘧啶(C)第5位的甲基从S-腺苷蛋氨酸(SAM)转移形成5 mC [4]。DNMT1参与细胞增殖过程中序列甲基化的维持，这是维持DNA甲基化模式以及癌细胞中TSG的异常沉默所必需的。DNMT3A有两种不同的亚型，而DNMT3B具有30多种亚型，其共同特征是都具有催化活性和结构保守的C-末端结构域，负责结合SAM辅因子并靶向胞嘧啶[5] [6]。总之，DNMT1参与序列甲基化的维持，而DNMT3A和DNMT3B的主要作用是de novo甲基化，也可以参与甲基化的维持。

3. 甲基化转移酶与急性髓系白血病

3.1. DNMT1在AML中的作用

DNMT1基因在人体位于19p13.2染色体上。DNMT1蛋白丰度在早期S期达到峰值，在DNA复制叉处定位，在G1期达到最低水平[7]。有研究指出[8]，降低DNMT1水平会减少RAS相关结构域包含蛋白1 (RASSF1A)和死亡关联蛋白激酶(DAPK)启动子的甲基化，RAS (rat sarcoma)是癌症中最常见的突变促癌基因，从而抑制癌细胞的增殖、侵袭和转移，提示在AML中DNMT1是一个潜在的癌蛋白。

3.1.1. miRNA对DNMT1的调控作用

miRNA是一组内源性小非编码RNA，长度为18-25个核苷酸，已知在转录后水平的基因表达调控中起关键作用[9]。DNMT1与miRNA之间可能存在着表观遗传上的相互作用。miRNA异常上调或下调与恶性肿瘤的发生、发展有关。WANG等[10]报道，DNMT1在AML细胞系中受到miR-148a的负调控，DNMT1的抑制导致miR-148a启动子中5’-胞嘧啶磷酸-鸟嘌呤-3’岛的甲基化水平降低，从而导致miR-148a表达升高，细胞就会增殖受限，并加速凋亡的发生。有研究表明miR-29b可通过靶向调控因子Sp1使DNMT1表达量降低，这说明也有部分miRNA可间接调控DNMT1 [11]。此外，Sichen等[12]发现DNA甲基化可以影响miRNA的表达。研究表明[13]，DNMT1的过表达导致miR-148a/152基因的高甲基化和miR-148a/152的下调。这些结果证实了HTR-8细胞和PE大鼠胎盘中DNMT1和miR-148a/152之间存在负反馈调节回路。故miRNA和DNMT1两者在AML里的关系和作用还有待通过实验和研究进一步证明。

3.1.2. DNMT1与其他调节因子的相互作用

据观察，在多重耐药AML细胞中，耐药相关基因HA117的抑制与DNMT1表达的下调有关[14]。事实上，当用MUC1-C抑制剂(一种在AML细胞中表达的跨膜癌蛋白)处理细胞时，AML细胞的存活率会降低。实验表明，MUC1-C通过激活NF-κB-p65通路轴诱导DNMT1表达，从而加速AML疾病的进展[15]。核仁素(NCL)是一种丰富的多功能磷蛋白，与DNA、RNA和蛋白质结合，是一种高度移动的蛋白质。AML发生的分子途径之一，是由核仁素核因子KB(NF-KB)-DNMT1调节轴导致的，在这一过程中，核仁素过表达增加了NFκB磷酸化并上调了DNMT1，随后是DNA高甲基化，相比之下，核仁素功能障碍使NFκB去磷酸化并消除DNMT1表达，导致整体DNA甲基化减少，p15INK4B表达恢复，p15INK4B启动子上的DNA低甲基化。值得注意的是，NFκB失活减弱，而NFκB过表达增强了DNMT1启动子活性和内源性DNMT1表达。总的来说，该研究将核仁素确定为白血病细胞中的非常规表观遗传调节因子，并证明核仁素-NFκB-DNMT1轴是AML白血病发生的新分子途径[16]。FABP4是脂质代谢的主要调节因子，在炎症和癌症中有重要作用[17] [18]。有研究发现，下调的DNMT1负责FABP4 DNA启动子的低甲基化，最终导致FABP4表达上调。此外，HTR-8细胞感染Ad-DNMT1后FABP4甲基化水平升高，进一步验证了DNMT1在FABP4低甲基化中的重要作用[19]。然而，导致DNMT1下调的机制在很大程度上是未知的。有研究表明，FABP4上调增加了IL-6的表达，信号转导和转录因子3磷酸化的激活因子导致DNMT1过表达和p15进一步沉默AML细胞中的肿瘤抑制基因。相反，FABP4消融减少了DNMT1依赖性DNA甲基化并恢复了p15INK4B表达，从而对AML增长提供实质性保护[20]。该研究结果揭示了FABP4/DNMT1轴在控制肥胖症AML细胞命运中的作用，并表明干扰FABP4/DNMT1轴可能是治疗白血病的新策略。

3.1.3. 蛋白激酶对DNMT1的作用

除上述调节因子外，DNMT的活性可通过蛋白激酶的磷酸化和稳定DNMT1，导致其活性的增强[21]。体酪氨酸激酶(RTK)是一种正调节因子，有研究发现，在AML细胞中，DNMT与RTK的表达呈正相关，若发生功能障碍，会致使DNMT表达和DNA甲基化降低，而使表观遗传沉默的p15INK4B激活，从而产抑制白血病细胞的生长[22]。这也提供了以RTK抑制剂为途径治疗表观遗传异常白血病的新思路。综上所述，DNMT1作为AML潜在表观遗传的治疗靶点，有待更加深入的研究阐明其作用机制。

3.2. DNMT3A在AML中的作用

DNMT3A是AML中最常见的突变基因[23]，负责从头DNA甲基化。在急性髓系白血病(AML)中，R882H突变的流行率很高。与影响其他密码子(非R882-DNMT3A)的错义突变相比，DNMT3A的错义突变影响精氨酸密码子882 (R882-DNMT3A)更常见，导致正常造血和正常甲基化缺陷[24]。在一大批AML患者中，随后在多个位点检测到复发性DNMT3A突变[25]。尽管化疗药物改善了DNMT3A突变AML患者的预后，但仍然没有靶向治疗，这凸显了进一步研究DNMT3A突变如何影响AML表型的必要性。

3.2.1. DNMT3A突变与其他基因突变之间的作用

DNMT3A突变本身不会引起恶性肿瘤，但通过一些人为或自然手段对生物体的遗传信息或基因表达进行干扰就能进展为白血病细胞[26]。DNMT3A突变常见于核型正常的AML，与法–美–英(FAB)M5形态相关[25] [26]。此外，DNMT3A突变与其他突变(如NPM1、FLT3和IDH1)的相关性更高[27] [28]。在野生型NPM1和野生型FLT3的CN-AML患者中，DNMT3A突变的存在导致预后不良[29]。与野生型DNMT3A患者相比，携带DNMT3A R882突变的患者的预后似乎更差，尽管目前尚无大型前瞻性研究。在此之前，为了确定这些患者的预后，应考虑其他经过验证的参数，如年龄、细胞遗传学异常、微小残留病(minimal residual disease, MRD)和其他突变的存在[30]。LUO等[31]通过分析一项AML患者的临床特点和预后，发现NPM1 + FLT3-ITD + DNMT3A三突变组较非三突变组生存期短、预后差，提示三突变有协同AML预后变差的作用。TANG [32]等就观察TSPO基因在FLT3-ITD/DNMT3A R882双突变AML疗效评估中的价值研究中，通过转录组测序方法检测TSPO基因在伴有FLT3-ITD突变，伴有DNMT3A R882突变及伴有FLT3-ITD/DNMT3A R882双突变的AML病人的表达量，两者单突变时TSPO基因表达量均高于对照组，双突变组初诊时TSPO基因表达量明显高于FLT3-ITD单突变组和DNMT3A R882单突变组，双突变组化疗后达到完全缓解的患者，达到完全缓解时的TSPO基因表达量明显低于其初诊时的水平，证实TSPO基因或许可以作为评估FLT3-ITD/DNMT3A R882双突变AML治疗疗效的一个指标。ZHANG [33]的临床研究发现伴有DNMT3A + TET2 + 双基因突变和伴DNMT3A突变的患者在OS上存在显著差异，多突变比较DNMT3A单突变的患者预后差，提示DNMT3A + TET2 + 双基因突变会促进AML患者疾病的进展。CEBPA是在粒细胞分化过程中起关键作用在转录因子。在AML中CEBPA突变率为7%~11%，并且CEBPA突变AML患者基因组DNA存在CpG高甲基化现象[34]。YE [35]等首次报道了CEBPA是DNMT3A的特异性抑制因子。通过筛选与DNA甲基化相关表观修饰酶形成复合物，发现了CEBPA与DNMT3A长剪切异构体之间存在特异性结合，该结合发生在DNMT3A蛋白N末端，显著降低了甲基转移酶DNMT3A对底物DNA的亲和能力，从而抑制DNA甲基转移酶活性。在培养细胞和动物模型中，还发现AML来源CEBPA突变能破坏CEBPA-DNMT3A复合物形成和解除对DNMT3A抑制效应，导致CEBPA突变AML细胞的基因组DNA高度甲基化和PRC2靶基因表达下调，并且对临床已用的DNMT抑制剂(DNMTi)靶向药物尤为敏感。

3.2.2. DNMT3A突变对AML的影响

DNMT3A突变是癌症发展过程中的早期事件，似乎会导致急性髓系白血病 (AML) 患者预后不良 使该基因成为新疗法的有吸引力的靶标[36]。有研究发现，DNMT3A突变患者较未突变患者OS和无复发生存期(RFS)较未突变患者明显缩短，而复发率明显升高[37]。SHU [38]通过回顾性分析初治成人AML患者的二代测序结果和预后生存，证实年龄、诱导化疗后疗效、FLT3-ITD突变、DNMT3A突变是影响成人AML患者OS、RFS的独立因素。WANG [39]等通过回顾分析160例初诊AML患者的临床资料，采用相关基因检测技术发现DNMT3A、FLT3、IDH2、RUNX1基因突变者相比于未突变者生存期缩短(P < 0.05)，结果分析显示DNMT3A突变可作为AML不良预后的独立预测因子。研究表明，很多经过化疗的AML患者在达到完全缓解(CR)后仍有DNMT3A R882突变。其原因可能是因为这种突变出现在早期造血干细胞中，与正常核型的AML相关。它们会在骨髓内分化成淋巴系和髓系细胞，通过克隆扩增抑制正常的造血功能[40]。JI [41]等发现CIMP-L中最常见的突变基因是DNMT3A，其与不良无事件生存和总生存相关[42]。DNMT3A抑制剂对表达CIMP-的AML患者可以改善其临床预后[43] [44]。有研究发现，部分DNMT3A突变的AML患者，在完全缓解时突变消失，在复发时又出现，这可能是AML持续复发的原因之一[45]。

3.3. DNMT3B在AML中的作用

DNMT3B也催化从头甲基化，主要影响血液系统恶性肿瘤的进展，可以引起异常甲基化的产生[46]。DNMT3B突变、多态性和表达对AML的预后有影响。DNMT3B过表达与老年CN-AML患者不良预后相关[47]。有研究发现，DNMT3B的缺失加速了MLL-AF9白血病的进展[48]，另有研究表明[49]，在T-ALL和BL中，DNMT3B的高表达导致DNA异常甲基化和MYC驱动的肿瘤发展。因此，进一步阐明DNMT3B在AML中的作用对于AML肿瘤的治疗及药物开发具有一定意义。

3.3.1. DNMT3B与miRNA的相互作用

DNMT3B与很多miRNA的表达密切相关，以miR-29b最具特征性[50]。miR-29b与DNMT3B的30个非翻译区直接产生相互作用，并下调其表达，从而导致高甲基化和沉默的p15INK4B在AML细胞中重新表达[51]。越来越多的证据表明，DNMT3B介导的高甲基化在促进白血病发生和AML侵袭性中的潜在机制，特别是涉及miRNA [11] [51] [52]。miR-375已被证明是各种癌症中的肿瘤抑制miRNA；其表达在AML患者(n = 102)中赋予了更好的OS (P = 0.007)和DFS (P = 0.015)，前体miR-375 (前miR-375)启动子的DNA高甲基化导致AML中miR-375的表达降低[51]。在同一项研究中，据报道，miR-375的过表达抑制了AML细胞的增殖和集落形成，并在白血病异种移植物小鼠模型(裸鼠中的HL-60细胞)中随着存活时间的延长而减小了肿瘤大小。更重要的是，HOXB3 (一种同源框蛋白)诱导DNMT3B表达结合前miR-375启动子，导致前miR-375的DNA高甲基化增加，导致AML细胞(HL-60和THP1)中miR-375的表达降低，这是一种新的miR-375-HOXB3-CDCA3/DNMT3B调控回路，抑制此信号通路可能使miR-375的表达恢复，而改善AML患者的预后。

3.3.2. DNMT3B高表达与预后不良相关

在AML中，DNMT3B的高表达可能作为患者预后差的分子生物学标志。在一项对151名儿童急性髓系白血病患者的甲基组和转录组的综合分析中[53]，DNMT3B表达增加和甲基化减少与较差的临床结果相关(Pс10-5; q = 0.002)，较高的DNMT3B表达与较差的最小残留病(MRD)、较高的复发率或耐药率、较差的EFS和较高的全基因组甲基化负荷(GWMB)相关，这意味着DNMT3B诱导的GWMB可能在儿科AML的侵袭性中发挥作用[43]。髓过氧化物酶(MPO)是一种通过细胞化学在白血病母细胞中测量的杀微生物蛋白，是诊断AML的生物标志物，其表达与AML患者更好的预后有关。发现[54] DNMT3B与CD34 + AML细胞中的MPO水平呈显著负相关(P = 0.0283)，与AML中的常见突变(FLT3-ITD、CEBPA或NPM1突变)没有显著关联。这表明[43] MPO基因转录可能通过DNMT3B的启动子甲基化受到抑制，尽管这有待功能研究的进一步证明。NIEDERWIESER等[55]对细胞遗传学正常的老年AML患者的多变量分析也证实DNMT3B高表达可作为OS、较低CR率和较短DFS和的独立预测因子。DENG [56]基于生物信息学分析和临床数据分析发现，DNMT3B表达水平与生存显著负相关(HR = 1.38, 95% CI: 1.09~1.74, P < 0.05)，可作为独立预后因素(P < 0.001)，但具体机制还有待研究。

3.3.3. DNMT3B抑制肿瘤的发展

有些证据表明，在AML中，DNMT3B可能是一个潜在的癌蛋白。不过，有研究也发现，它在AML进程中还可以抑制肿瘤的发展[57]。有研究发现[58]，在儿童AML样本中DNMT3B表达与脑膜瘤癌基因(MN1)表达呈负相关，地西他滨暴露后，DNMT3B的耗尽会损害AML细胞中MN1外显子位点的再甲基化效率。这些发现表明DNMT3B是MN1甲基化的重要共调节因子，因此表明DNMT3B通过MN1甲基化调节在inv(16) AML的白血病发生中发挥作用，可能抑制AML的疾病进展。ZHENG等[57]通过敲除小鼠MLLAF9 AML白血病细胞中的DNMT3B，证明DNMT3B缺失会加速MLLAF9 AML的演变，这是因为其促进干细胞的增加和细胞周期导致的。因此，DNMT3B在AML进展过程中可能还起着抑制肿瘤的作用，有待进一步阐明其作用机制。

4. 结语

目前对白血病的遗传学及表观遗传学的研究已经取得了较显著的成果，但AML是一种高复发率及高死亡率的血液系统恶性肿瘤，故需继续深入探索其发病机制及寻找新的治疗方案。DNA甲基化在表观遗传机制中有着十分重要的地位，建立和维持DNA模式所必需的酶是DNMT，不断探索AML发病机制中DNMT的作用和意义对AML的临床治疗将具有重大的指导意义。尽管已知表观遗传调节对AML的治疗有效，但表观遗传的相关治疗药物在体内的作用效果尚未得到详细的说明，因此，对于DNMT的深入研究可以起到推动该领域发展的作用，能够为AML的表观遗传疗法带来更多的靶向药物和治疗方向。