基于影像组学的结直肠癌预后模型构建

Construction of Colorectal Cancer Prognostic Model Based on Radiomics

摘要: 目的：本研究旨在探讨结合影像组学和基因组学数据评估结直肠癌(colorectal cancer, CRC)预后的价值。方法：从癌症影像档案馆(The Cancer Imaging Archive, TCIA)中获取结直肠肝转移、TCGA-COAD和TCGA-READ数据集，包括225例结直肠癌患者的影像学数据和654例基因组数据。手动勾画结直肠癌肿瘤边缘以定义感兴趣区域(the region of interest, ROI)。采用LASSO回归和10倍交叉验证进行特征选择及核心DEGs选择，后进行Kaplan Meier (K-M)生存分析和多变量COX回归分析。TCGA-COAD和TCGA-READ数据集以7:3的比例随机分为训练集和验证集。对训练集中选定的基因和放射组学特征进行多变量COX回归分析。通过前向–后向逐步回归选取关键指标。通过时间依赖ROC曲线和校准图评估验证集中的模型性能。结果：共提取5个关键特征。K-M生存分析显示，与高风险组相比，低风险组的总生存期明显更长(P < 0.0001)。对TCGA-COAD和TCGA-READ基因组数据进行差异分析，筛选出8个关键基因。对训练集中选定的影像组学特征和关键基因，构建了由3个基因(PCOLCE2: P = 0.027, PTH1R: P = 0.009, UBQLNL: P = 0.008)组成的基因组学–影像组学联合模型。COX回归结果显示，以上模型的风险评分与CRC预后存在显著相关性(P < 0.05)。在1年、3年和5年的验证集中，预测存活率与实际存活率之间有显著的相关性。结论：由以上3个基因组成的基因–影像组学联合模型对CRC预后具有良好的预测能力和应用价值。

Abstract: Objective: This research endeavors to investigate the practical utility of combining radiomics and genetic data for assessing the prognosis of colorectal cancer (CRC). Methods: We obtained the Colorectal Liver Metastases, TCGA-COAD, and TCGA-READ datasets from The Cancer Imaging Archive (TCIA), including imaging data from 225 colorectal cancer patients and transcriptome data from 654 cases. CRC tumor margins were manually outlined to define the region of interest (ROI). LASSO regression and 10-fold cross-validation were used for feature and DEGs selection, followed by Kaplan Meier (K-M) survival analysis. and multivariate COX regression analysis. The TCGA-COAD and TCGA-READ datasets were randomly split into training and validation sets with a 7:3 ratio. We conducted multivariate COX regression analysis on the selected genes and radiomic features in the training set. Key indicators were chosen through forward-backward stepwise regression and visually presented with a forest plot. Model performance in the validation set was assessed through time-dependent ROC curves and calibration plots. Results: We’ve effectively filtered out 5 pivotal features. K-M survival analysis revealed a significantly longer overall survival in the low-risk group compared to the high-risk group (P < 0.0001). Differential analysis of the transcriptome data from TCGA-COAD and TCGA-READ identified and eight key genes were chosen. A gene-radiomics combined model consisting of three genes (PCOLCE2: P = 0.027, PTH1R: P = 0.009, UBQLNL: P = 0.008) was constructed using COX regression analysis on the selected radiomics features and key genes in the training set. The COX regression results indicated a significant association between these three genes, radiomics risk score, and the prognosis of CRC (P < 0.05). The calibration curve indicated a strong match between the predicted survival rate and the actual survival rate across these time points. Conclusion: The gene-radiomics combined model composed of three genes (PCOLCE2, PTH1R, and UBQLNL) demonstrates good predictive ability and application value for CRC.

1. 引言

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是消化系统中最普遍的恶性肿瘤之一。国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)的《2020年全球癌症统计报告》显示，结直肠癌的发病率在所有癌症中排名第三，死亡率位居第二[1]。由于其无症状临床表现，50%~60%的患者被诊断为晚期结直肠癌，其中80%~90%的患者出现不可切除的肝转移瘤，预后不佳[2]。据报道，CRC的5年生存率低于12% [3]。手术、化疗、放疗、靶向治疗、免疫治疗以及各种联合疗法是结直肠癌的主要治疗方法[4]。尽管现代诊断和治疗技术取得了重大进展，但结直肠癌仍然是全球健康的主要威胁[5]。因此，开展结直肠癌诊断、治疗和预后预测的研究至关重要。

近年来，手术技术的优化、新型辅助疗法的引入以及影像学检查方式的快速发展，使死亡率显著降低[6]。医学成像在诊断、分期和评估结直肠癌治疗效果方面具有重大价值，有助于为患者确定合适的治疗方法。放射组学的特点是通过计算或统计方法对各种医学扫描(如CT、MRI、PET和US图像)进行定量评估，能够对超越形态学和宏观属性的图像进行定量评估。通过计算病变区域内灰度分量的统计信息，

生成定量纹理特征，这些特征可以进行统计分析并与临床问题相关联[7]，可用于提高诊断和预测性能。近年来，利用影像组学技术对结直肠癌进行了广泛研究，证明了其潜在的应用价值[8]-[10]。

随着技术的不断进步，影像组学近年来在多种疾病中得到了广泛的关注。多项研究报道了放射组学特征与肺癌中EGFR突变[11]和ALK重排[12]之间的相关性。在乳腺癌的诊断和治疗中，已经发现了放射组学与基因序列水平[13]和基因表达水平[14]之间的关联。然而，关于放射组学和RNA-Seq联合用于结直肠癌预后评估的报道很少。本研究从结直肠肝转移、TCGA-COAD和TCGA-READ数据库中检索放射组学和RNA-Seq信息，利用获得的影像组学特征和关键基因预测结直肠癌的预后，为结直肠癌的精准治疗提供依据。

2. 资料与方法

2.1. 图像采集和分割

结直肠肝转移、TCGA-COAD和TCGA-READ数据集，包含225名结直肠癌肿瘤CT图像和654例RNA-seq信息，均来自癌症影像档案馆(The Cancer Imaging Archive, TCIA)数据库(https://public.cancerimagingarchive.net/)。使用3D Slicer软件(v5.1.0, Maryland, Bethesda, USA)对原始CT图像进行分割，手动勾画感兴趣区域(the region of interest, ROI)边缘，获得包含分割ROI的3D图像。

2.2. 影像组学特征的提取和选择

使用3D Slicer软件中的“PyRadiomics”进行特征提取。该插件自动从每个ROI中提取851个放射组学特征，包括162个初始统计参数、107个基于形状和大小的特征、675个纹理特征和744个小波特征。通过Z分数对提取的特征进行标准化。本研究使用R软件的“glmnet”(v4.0.1, Lucent Technologies Inc., Union, NJ, USA)应用LASSO回归分析进行特征选择。通过10次交叉验证，确定对应最低误差的最佳λ。最后，选取与CRC显著相关的影像组学特征。

2.3. 影像组学特征的预后分析

K-M生存评估是一种生存分析方法。它利用观察到的个体生存时间(以死亡为结果事件)或无复发时间(以局部复发或远处转移为结果事件)来估计生存概率[15]。本研究中，使用R软件中的生存包对选定的重要特征进行生存分析，并获得预测风险评分。采用R软件中的“survminer”工具绘制risk score，并利用最大选取的秩统计量确定临界值。根据临界值将个人分为高风险组和低风险组。生成K-M生存曲线以说明高风险/低风险个体与其无进展生存期和个体生存概率的关联。

2.4. TCGA的RNA测序信息的差异分析

采用R软件中的“DESeq2”包对TCGA-COAD和TCGA-READ数据集(正常组与肿瘤组)的RNA测序数据进行差异分析。通过R软件“ggplot”和“pheatmap”包的帮助，对结果进行可视化，分别生成火山图和热力图。

2.5. 核心基因选择与预后分析

利用LASSO回归分析研究差异表达基因，并通过10倍交叉验证选择关键基因，然后对过滤的关键基因进行K-M生存分析。利用R软件中的“survival”和“survminer”包对选定的关键基因进行多因素COX回归分析，并使用“forestplot”包生成森林图。通过t检验评估年龄、性别、肿瘤分级、病理T分期和N分期风险评分的统计学差异。采用联合COX回归分析确定临床和病理特征的预后价值。

2.6. 基因–影像组学联合分析与评价

TCGA-COAD和TCGA-READ数据集以7:3的比例随机分为训练集和验证集。在训练集中，对选定的基因和影像学特征进行多变量COX回归分析，以确定与CRC预后相关的关键指标。采用前–后逐步回归进行特征选择，生成森林图对结果进行可视化。在验证集中使用time-dependent ROC曲线和校准曲线评估模型校能。利用R软件中的“rms”包生成列线图，评估关键基因表达水平和风险评分对CRC预后的预测效能。LASSO模型的敏感性(Sensitivity)和特异性(Specificity)通过ROC曲线进行评估。采用校准曲线评估模型概率预测的可靠性。在水平维度上将预测概率与在不同预测概率下垂直维度上的真实样本比例进行映射，这些曲线有助于评估模型预测的准确性。

2.7. 统计分析

统计分析是使用R软件(v. 4.0.1, Lucent Technologies Inc., Union, NJ, USA)进行的，显著性水平设定为P < 0.05。

3. 结果

3.1. 结直肠癌影像学特征的分析与预后评价

采用LASSO回归分析从数据集中提取成像特征，确定最合适的正则化系数λ。为了验证LASSO结果的稳健性，进行10倍交叉验证，从而选择了5个重要特征(图1(A)、图1(B))。通过K-M生存分析，我们观察到，当生存概率达到0.5 (P < 0.0001)时，低风险个体的总生存期(overall survival, OS)明显延长(P < 0.0001) (图1(C))。

(A)

(B)

(C)

Figure 1. Feature selection and prognosis analysis of imaging features. (A) LASSO coefficient spectrum. (B) 10-fold cross-validation. (C) K-M survival assessment

图1. 影像学特征选择和预后分析。(A) LASSO系数谱。(B) 10倍交叉验证。(C) K-M生存评估

3.2. TCGA-COAD和TCGA-READ的RNA-Seq数据集的差异分析与预后

通过对TCGA-COAD和TCGA-READ的RNA-Seq筛选，共识别出8525个DEG (图2(A))。执行PCA以可视化正常样本和肿瘤样本之间的不同基因表达模式(图2(A))。火山图显示，1370个DEGs上调，7155个DEGs下调(图2(A))。

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

(A) 差异表达分析(左：差异表达基因热图；中心：差异表达基因主成分分析，蓝色圆圈代表正常组，红色三角形代表肿瘤组；右：差异表达基因火山图)。(B) LASSO系数曲线。(C) 10倍交叉验证。(D) K-M生存评价。(E) 多变量COX回归分析。

Figure 2. Selection of key DEGs in TCGA RNA-Seq Dataset

图2. TGGA RNA-Seq数据库关键DEGs的选择

通过LASSO回归和10倍交叉验证，本研究确定8个关键基因(图2(A)、图2(B))。当生存概率达到0.5时，8个基因低表达患者生存期明显延长(INHBB: P < 0.0001, PCOLCE2: P < 0.0001, PTH1R: P = 1e−4, HOXD4: P < 0.0001, KCNQ2: P = 0.00021, UBQLNL: P < 0.0001, MID2: P = 0.00095, HOXC4: P < 0.0001) (图2(D))。对8个关键基因进行多因素COX回归评估，生成森林样图，一致性指数为0.68 (图2(E))。

3.3. 结直肠癌患者预后因素的识别及风险分层

使用COX回归风险评分，将个体分为高危险和低危险组。8个关键基因的高表达显著增加了癌症相关死亡的风险(图3(A))。此外，使用t检验观察到肿瘤分级、病理T分期和N分期的风险评分存在显着差异(图3(B))。为进一步探讨这些因素是否为结直肠癌的独立预后因素，进行了单因素和多因素COX回归分析。研究结果显示，年龄、肿瘤分级、病理T分期和病理N分期显着影响总生存期(图3(C))。重要的是，当将这些变量纳入多变量COX回归检查时，年龄(P < 0.001)、肿瘤分级(P < 0.001)和病理N分期(P = 0.007)与预后保持显著联系(图3(D))。

(A)

(B)

(C)

(D)

(A) 8个CRC预后预测基因的风险评分、生命体征和表达模式的综合分布。(B) 比较按年龄、性别、肿瘤分级、病理T分期和病理N分期划分的风险评分差异。(ns表示不显著，^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001，^****P < 0.0001)。(C) CRC患者临床病理特征与OS关联的单因素COX回归分析森林图。(D) CRC患者与OS关联的多因素COX回归研究森林图。

Figure 3. Correlation of COX survival model with overall survival and clinicopathological characteristics

图3. COX生存模型与总生存期和临床病理特征的相关性

(A)

(B)

(C)

(D)

(E)

(A) 放射组学特征和关键基因风险评分的前向–后向逐步回归分析。(B) 三个关键基因在对照组和肿瘤组之间的差异表达。(C) 联合COX回归分析结果列线图。(D) time-dependent ROC曲线对组合模型进行性能评估。(E) 评估模型预测准确性的校准图。

Figure 4. Evaluation of selected genes and radiomics features in combination

图4. 基因组学和影像组学特征的组合评估

3.4. 利用基因–影像组学联合分析建立CRC预后模型

在训练集中，对选定的影像组学特征和关键基因(图4(A))进行COX回归反分析，构建了由3个基因(PCOLCE2：P = 0.027，PTH1R：P = 0.009，UBQLNL：P = 0.008，风险评分：P = 0.015)组成的CRC预后模型，一致性指数为0.89。PCOLCE2、PTH1R和UBQLNL在肿瘤组中的表达明显低于正常组(P < 0.0001) (图4(B))。此外，列线图显示PCOLCE2、PTH1R、UBQLNL基因和影像组学特征的风险评分与CRC的预后之间存在显着的关联，表明该模型能够精确预测CRC预后(图4(C))。

在验证集中，模型在1年、3年和5年的AUC分别为0.80、0.87和0.84，表明将影像组学特征与PCOLCE2、PTH1R和UBQLNL基因相结合可提高预测预后的准确性和敏感度(图4(D))。校准图显示，预测生存率与1年、3年和5年的实际生存率之间具有令人满意的匹配度(图4(E))，表明该模型具有出色的预后能力和临床价值。

4. 讨论

CRC具有复杂的生物学特征，并表现出高度的空间表型和基因型变异性，即肿瘤异质性[16]。传统的定性成像方式(如CT和MRI)在评估肿瘤异质性方面显示出局限性。定量成像方法能够评估肉眼无法识别的图像信息，从而提供更客观的测量结果。影像组学将病理和生理信息转化为可分析的高维定量图像特征，为使用医学成像进行准确诊断、精确分期和生存分析预测提供了一种科学可行的方法。并提高了早期癌症筛查和患者预后预测的准确性[17]。CT影像组学已被证明在结直肠癌的各个方面都很有价值，包括早期诊断[18]、治疗评估[19]、风险分层[20]和肿瘤异质性评估[21]。近年来，学者们深入研究了影像组学在预测结直肠癌预后中的应用。Lv等[18]通过机器学习建立了结合影像组学特征和临床生物学特征的生存模型，预测了CRC原发肿瘤的预后。结果表明，影像组学方法在辅助CRC精准治疗的管理和决策方面具有潜在价值。Li等[22]提出了一种结合临床危险因素和影像组学特征的预测模型，用于准确预测CRC患者的淋巴结转移，用于治疗决策和预后评估。Wang等[23]构建了基于机器学习的病理影像组学、影像学特征、免疫核心和临床因素的模型来预测肺转移CRC患者的术后预后，成功地利用病理影像组学和影像学特征来预测总生存率。

随着放射组学和高通量分子全息技术的进步，提供医学图像和肿瘤分子信息的公共数据集的可用性越来越高。影像组学特征和分子生物标志物之间的互补关系为影像学表型的分子注释提供了更全面的理解[24]。影像组学将放射学特征(如病变大小、形状、密度、增强特征、纹理特征等)与基因组数据相结合，深入探索两者之间的关联，可以反映基因表达或影像学特征的多样性，从而更深入地理解疾病的发生和发展状态[25]。研究表明，影像组学和基因组学的联合分析可以提高包括结直肠癌在内的各种癌症生存率预测的准确性，Chaddad等[26]通过影像组学、临床组学及基因组学的融合模型提高IDH1野生型胶质母细胞瘤生存率的预测能力(AUC 78.24%, P < 0.001)。Badic等[27]通过将增强CT放射学特征与基因表达数据相结合，发现ABCC2基因表达的变化与某些放射学特征之间存在相关性。他们还发现ABCC2基因表达与结直肠癌患者N分期和M分期、临床分期、ABCC2预测无进展生存期之间存在关联，表明影像组学可以增强结直肠癌患者放射学检查的预后判断能力。因此，放射组学分析有助于更好地了解分子特征，并为癌症患者的精准治疗提供预测指标。

在本研究中，我们首先对CRC肿瘤的CT图像进行放射组学分析，并通过LASSO回归和10倍交叉验证选取5个特征。K-M生存分析显示，与高风险组相比，低风险组的总生存期明显延长。TCGA-COAD和TCGA-READ RNA-Seq信息的差异分析确定了1370个上调DEGs和7155个下调DEGs。通过10倍交叉验证和LASSO回归分析，选取8个关键基因。K-M生存分析表明，与高表达组相比，低表达组的总生存期明显更长，表明这些基因会影响CRC患者的生存率。随后，我们进行了放射组学和基因组学的联合分析，建立了由三个基因(PCOLCE2、PTH1R和UBQLNL)组成的基因–放射组学模型。该模型的一致性指数为0.89，准确度高于基于基因组学模型(一致性指数 = 0.68)。此外，森林图结果显示，该模型与CRC预后的风险评分呈显著相关性(P < 0.05)。校准曲线表明，在1年、3年和5年的时间间隔内，预测生存率与实际生存率之间具有良好的拟合性。我们的结果表明，CT影像组学和基因组学的联合分析可有效预测结直肠癌预后，这与Badic等人的研究结果一致[27]。

原胶原C-内肽酶增强子2 (PCOLCE2)是一种参与胶原形成和细胞外基质降解的蛋白质编码基因。据报道，PCOLCE2是CRC的预后基因，可用于构建CRC预后模型[28]，这与我们的研究结果一致。此外，通过外显子测序发现PCOLCE2在结直肠癌中发生突变[29]。PTH1R是甲状旁腺激素的1型受体，调节血液中钙和磷酸盐的浓度。Liu [30]等人提出，PTH1R在结直肠癌肝转移过程中参与miRNA和DNA甲基化，但PTH1R在结直肠癌中的预后价值需要进一步验证。UBQLNL属于泛素蛋白家族。UBQLNL是UBQLN家族的重要成员，其在结直肠癌组织样本中的表达显著上调，在结直肠癌的临床诊断和预后分析中具有潜在的应用价值[31]。然而，UBQLNL在结直肠癌中的预后作用需要进一步验证。

本研究结合影像组学和基因组学进行综合分析，构建了包括三个特定基因的CRC预后预测模型。并且，以上模型增强了CRC患者临床诊断、治疗和预后的预测能力。尽管如此，我们的研究仍具有某些局限性，需要通过外部数据集和实验进行额外的验证。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突。

NOTES

^*通讯作者。