1. 引言
血人参是豆科木蓝属植物茸毛木蓝(Indigofera stachyodes Lindl.)的干燥根部。这种植物在贵州苗族中被广泛使用，也被称为铁刷子《贵州民间方药集》、山红红苦刺《云南中草药》和雪人参。它的味道是甘的，稍带苦味，性质偏温，与肝、肾、大肠经有关。血人参具有滋阴补虚、调经摄血、活血舒筋的功效，主要用于治疗崩漏、体虚久痢、肠风下血、溃疡不敛、风湿痹痛、跌打损伤、肝硬化、疳积等疾病[1] [2]。血人参主要分布在云南、贵州、福建、广西等地区，特别是在贵阳、安顺、黔西南、黔东南等地有广泛的分布[3]。
血人参含有丰富的化学成分，目前已知主要有挥发油、甾醇体类、黄烷醇等[4]。血人参在临床中应用较多，根据相关文献总结，血人参具有抗氧化、降糖、降脂、保肝等诸多药理作用[4]。在医学研究领域中，血人参具有解表、化痰、补血活血等药理作用。可以治疗咳嗽感冒发烧、肺痈等疾病。血人参含有丰富的化学成分，目前已知主要有挥发油、甾醇体类、黄烷醇等[4]。
肺痈是一种严重的肺部感染，常由细菌或真菌引起。尽管现代医学提供了多种抗生素和抗真菌药物，但在某些情况下，患者可能对这些药物产生耐药性，或者药物无法有效渗透到感染部位[5] [6]。肺痈系因风热邪毒在肺蕴滞，热壅血瘀和血腐化脓而成，临床上以发热、胸痛、咳吐腥臭脓血痰等症状为主要表现[7]。当今大多根据疾病的进展情况，把肺痈划分为初期、成痈期、溃脓期和恢复期。其中，初期为风热(寒)侵袭卫表内郁于肺，以致郁热伤肺，肺失清肃，此阶段以风热表证为主，多有恶寒发热、咳嗽、胸痛等症，当肺气受损导致肺部失去其清肃功能，痰液会增多，经常会咳嗽并吐出白色的黏痰。痰的数量会从少逐渐增加，因此治疗时应选择具有疏散风热和清肺化痰效果的银翘散[5]。肺痈是一种外邪犯肺，或痰热蕴肺，以致热壅血瘀，肺叶生疮，形成脓疡，出现以咳嗽、胸痛、发热、咯吐腥臭浊痰、甚则脓血相兼为主要表现的肺系疾病[8]。因此，开发新的治疗策略对于改善肺痈患者的临床预后至关重要。血人参是一种传统中药，已被用于治疗多种疾病，包括呼吸系统疾病。然而，血人参治疗肺痈的具体机制尚不清楚。因此，本研究旨在利用网络药理学方法，结合血人参的入血成分，探讨血人参治疗肺痈的可行性及其可能的潜在机制。
2. 方法
2.1. 实验材料
2.1.1. 血人参
血人参是从贵阳市花溪区采集的，经过贵州中医药大学的魏升华教授的鉴定，被确定为豆科中的木蓝属植物，具体为茸毛木蓝(Indigofera stachyodes Lindl.)，干燥根部入药。
2.1.2. 动物
32只SD雄性(排除雌性体内特殊激素水平影响)大鼠的体重大约在280~300 g之间，它们是从长沙市天勤生物技术有限公司(SCXK(湘)2019-0014)购买的；经过7天的适应喂养，室温控制(22 ± 2)℃，相对湿度控制(55 ± 5)%，每天早上9点添加饲料及水，自由摄食饮水。
2.1.3. 剂量设计
参照《中华本草苗药卷》，血人参成人每日推荐剂量为9 g~15 g，设置人体推荐剂量的2倍30 g作为干预剂量，以保证血人参有效入血成分尽可能被检测到；体表面积法计算得到大鼠每天的灌胃剂量为2.7 g/kg。
2.2. 实验方法
2.2.1. 含药血浆的制备
1) 血人参药液制备：将称好重量的血人参药材加入8倍水(1 g/8 ml)浸泡30 min后大火煎煮，待水沸腾后小火再煎45 min，将药液过滤倒入量杯。上述操作继续加水煎煮第二次，待水沸腾后小火煎煮20分钟，过滤倒入量杯与一煎药液合并，并浓缩为1.0 g/ml的药液，装入50 ml离心管中后保存在4℃的冰箱。
2) 动物进行分组、给药以及取血：32只SD雄性大鼠(280 g~300 g)适应性喂养一周后把它们随机分为4组，每组8只。各组分别命名为空白血浆组、给药后1 h/2 h/3 h采血组，其中三组血人参给药组，每天上午9:00以灌胃的方式给药(2.7 g/kg)，1次/天，连续给药7天，最后一天分别于最后次灌胃给药后1 h、2 h、3 h进行采血；空白组灌胃相同体积生理盐水，灌胃次数及天数与给药组一样。
3) 制备含药血浆：在采血前12小时，实验动物需禁食但不禁水。三组灌胃给药组的大鼠，需在第7天早晨最后一次灌胃后1小时和2小时分别进行腹腔注射，注射内容为10% (0.3 ml/100 g)的水合氯醛，用以实施麻醉。随后，通过腹主动脉采血，并将所采血液收集至洁净的EDTA抗凝管中。采血后应立即轻柔地倾斜颠倒采血管4~5次，以确保抗凝剂充分接触血液发挥作用，完成标记后静置30分钟，然后在4℃、3500 rmin的条件下进行离心15分钟，将上层血浆转移至无菌的15 ml离心管中，将管放入56℃的恒温水浴锅中加热30分钟以灭活补体，随后通过0.22 μm的微孔滤膜进行过滤分装，最后将其存放入−80℃冰箱以备后续使用。
2.2.2. 血人参含药血浆有效入血成分HPLC-MS鉴定结果
基于HPLC-MS非靶向的方式对血人参水煎剂、大鼠空白血浆、灌胃给药后2 h采血组含药血浆进行检测，我们获得的数据被用于生物信息学的分析和代谢物的鉴定。首先，我们需要根据精确的分子量来确定(分子量误差小于5 ppm)，如果误差小于5 ppm，则说明精确的质量误差确保了分子式的准确性。接下来，我们将依据MSMS碎片模式，对Human Metabolome Database (http://www.hmdb.ca/)、LipidMaps (http://www.lipidmaps.org/)、mzClound (https:www.mzcloud.org)以及帕诺米克自建标准品数据库进行确认注释，以获取代谢产物。
2.2.3. 血人参活性成分获取及靶点的预测
将血人参的交集成分输入TCMSP数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和SymMap (https://www.symmap.org/)数据库。在TCMSP测试中，当口服生物利用度OB值达到或超过30%时，筛选出的化合物被视为血人参的潜在活性成分。将化合物输入SwissTargetPrediction (http://www.swisstargetprediction.ch/)和Similarity ensemble approach (https://sea.bkslab.org/)数据库预测靶点。利用UniProt (https://www.uniprot.org/)技术，我们将所有的目标蛋白转化为与“homo sapiens”物种匹配的基因标记，并最终确定了标准的MB靶点。
2.2.4. 疾病靶点的获取
在GeneCards (https://www.genecards.org/)和OMIM (https://www.omim.org/)数据库以“肺痈”作为检索的关键词查询发热相关靶点后进行收集。
2.2.5. 交集靶点的获取及MB药物–成分–靶点网络的构建
利用软件R (4.2.1)得到发热和MB的交集靶点，使用Cytoscape 3.9.1可视化活性化学成分与交集靶点之间的关系，以构建MB治疗发热的靶点调节网络。
2.2.6. PPI网络的构建与核心靶点的筛选
我们首先将交集靶点导入到STRING (https://cn.string-db.org/)中，然后将蛋白质分类为“Homo sapiens”，并确保其最大置信水平不低于0.7 [9]。在隐藏网络中未连接的节点后，我们进行了蛋白质之间的相互作用(PPI)分析，并使用Cytoscape 3.9.1软件对这些数据进行了可视化处理。利用CytoHubba插件对关键靶点进行筛选，构建了关键靶点网络图。
2.2.7. GO、KEGG通路富集分析
对关键靶点进行富集分析，我们使用KEGG rest API (https://www.kegg.jp/kegg/rest/keggapi.html)获取了最新的KEGG Pathway的基因注释，以此作为背景，将基因映射到背景集合中，使用R软件包clusterProfiler (version 3.14.3)进行富集分析，以获得基因集富集的结果。我们使用R (4.2.1)编程语言对关键靶点进行GO富集分析，并下载了相关的数据。然后，我们选择了P < 0.05且排名前列的前十个通路，并将它们导入微生(http://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化展示。
2.2.8. 分子对接验证
从UniProt (https://www.uniprot.org/)数据库中检索关键基因的蛋白质结构，并从RCSB PDB (https://www.rcsb.org/)蛋白数据库中下载蛋白结构。从TCMSP (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)数据库中获取活性化合物的小分子配体。将蛋白结构和小分子配体导入CB-dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/php/index.php)在线分析工具进行分子对接。
3. 结果
3.1. 血人参活性成分的获取
为了获取血人参的有效入血成分，对比分析空白大鼠血浆和灌胃给药后1 h和2 h采血组含药血浆筛出的成分，结果显示，二者有100和107个成分在交集之外(图1)。接着通过对空白组交集以外的成分与中药煎剂成分取交集，最终得到11个有效化合物成分(图1和表1)，这11个化合物成分可能为血人参影响肺痈的免疫反应、炎症反应和细胞凋亡的药效物质基础。
注：(A) 含药血浆成分交集图；(B) 1 h含药血浆成分图；(C) 2 h含药血浆成分图。
Figure 1. Acquisition of constituents from I. stachyodes Lindl.
图1. 血人参成分的获取
3.2. 血人参药物靶点和疾病靶点的获取
以OB值 ≥ 30%作为条件筛选出11个活性成分(表1)，通过TCMSP、SwissTargetPrediction和SEA数据库预测得到377个相关靶点。GeneCards数据库以Relevance score > 1为筛选条件得到靶点2051个。在OMIM数据库共获得发热相关靶点230个。合并并去重两个数据库的靶点共获得2243个疾病相关靶点。运用R (4.2.1)语言对血人参的相关靶点和发热的靶点取交集共得到113个(图2)。
Table 1. Information on common constituents
表1. 交集成分信息
MOL ID |
成分 |
OB |
MOL001831 |
Hypoxanthine |
52.29 |
MOL009132 |
3-Dehydroshikimate |
46.09 |
MOL013179 |
Fisetin |
52.6 |
MOL003504 |
4-Methylbenzaldehyde |
44.18 |
MOL001332 |
(R)-mandelic acid |
43.67 |
MOL010834 |
Phenyl acetate |
33.87 |
MOL000570 |
2-Naphthylamine |
39.82 |
MOL001788 |
Adenine |
62.81 |
MOL011381 |
Pyrrole-2-carboxylic acid |
78.72 |
MOL001332 |
Mandelic acid |
43.67 |
MOL002645 |
Phenylethylamine |
42.96 |
Figure 2. Drug-disease intersection diagram
图2. 药物–疾病交集图
3.3. 药物–成分–靶点网络的构建
借助R语言的ggplot2包[10]和VennDiagram包[11]工具，我们可以对所得结果实现可视化展现(图3)。我们通过生成属性文件并将其整理成分–靶点格式，得到了称为“药物–成分–靶点”的文件，接着导入Cytoscape 3.9.1代码以获得该“药物–成分–靶点”网络图，如图3所示。在此之中，蓝色的菱形代表血清中的人参有益成分，而粉红色的六边形则是交叉目标，血人参用绿色的箭形表示。
Figure 3. Disease-component-target network diagram
图3. 疾病–成分–靶点网络图
3.4. PPI网络及核心靶点分析
将STRING中下载的TSV文件导入Cytoscape 3.10.2中，去除掉游离的靶点，获得PPI网络图(图4(A))。通过CytoHubba插件MCC算法得到15个关键靶点(EGFR, SRC, PLCG1, PIK3R1, PTK2, KDR, RHOA, AKT1, MET, MMP9, TNF, CXCL8, PTGS2, ALB, PIK3CG)，按照Score排列(图4(B))。
注：(A) PPI分析网络图；(B) 核心靶点网络图。
Figure 4. PPI network diagram and core target network diagram
图4. PPI网络图及核心靶点网络图
3.5. 通路富集分析
运用R (4.2.1)语言的R包(clusterProfiler (4.4.4)) [12]对15个Hub gene进行GO、KEGG富集分析。GO富集分析中P < 0.05的BP有1261条，CC有41条，MF有85条。挑选生物学过程和选取基因定位、分子功能前十条通路绘制成图(图5(C))，血人参治疗肺痈的机制可能归因于15个Hub gene主要参与了细胞运动的正向调节、上皮细胞的调节、细胞迁移、蛋白激酶B信号等生物学过程；基因主要定位在锚定连接、膜的侧面、细胞前缘、质膜的外源性成分等。KEGG富集分析中P < 0.05的通路共有122条，其中主要富集于VEGF信号通路、Rap1信号通路、TNF信号通路、ErbB信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂等(图5(A)、图5(B))。
注：(A) KEGG气泡图；(B) KEGG旋图；(C) GO分析图。
Figure 5. GO/KEGG enrichment analysis diagram
图5. GO/KEGG富集分析图
3.6. 分子对接
我们将这6个关键目标点的蛋白质结构及其相应的化合物结构引入CB-dock2实时分析设备中，以进行分子级的对接工作。如表2展示的分子对接效果中，Vina score代表了采用Vina编程，并根据相关的口袋属性对受体与配体结合模式的预测评分，Vina score意味着受体和配体的亲和度较高的数值较低。EGFR与Fisetin之间的亲和性极为强大，其数值为−8.1值；SRC与Fisetin的亲和力最高(Vina score = −8.7)，PLCG1与2-Naphthylamine的亲和力最高(Vina score = −7.9)，PIK3R1与Fisetin的亲和力最高(Vina score = −8.2)，PTK2与Fisetin的亲和力最高(Vina score = −8.3)。
Table 2. Molecular docking information table
表2. 分子对接信息表
成分 |
MOL ID |
蛋白 |
Uniprot ID |
Vina score |
Fisetin |
MOL013179 |
EGFR |
P00533 |
−8.1 |
Phenyl acetate |
MOL010834 |
EGFR |
P00533 |
−5.8 |
Fisetin |
MOL013179 |
SRC |
P12931 |
−8.7 |
2-Naphthylamine |
MOL000570 |
PLCG1 |
P00533 |
−7.9 |
(R)-mandelic acid |
MOL001332 |
PLCG1 |
P00533 |
−5.7 |
Fisetin |
MOL013179 |
PIK3R1 |
P27986 |
−8.2 |
Fisetin |
MOL013179 |
PTK2 |
Q05397 |
−8.3 |
4. 讨论
血人参含有丰富的化学成分，目前已知主要有挥发油、甾醇体类、黄烷醇等。根据前期研究表明，血人参药理作用广泛，如抑制氧化、降糖、降脂、保护肝脏等，本文章从血人参的药学成分出发，运用网络药理学的方法，探讨了血人参治疗肺痈的可行性及其可能的潜在机制。
根据药物–成分–靶点网络图可知，通过筛选得到11个有效成分，113个潜在靶点。为进一步得到关键靶标，进行了PPI网络分析及CytoHubba插件分析，筛选出了15个关键靶点(EGFR, SRC, PLCG1, PIK3R1, PTK2, KDR, RHOA, AKT1, MET, MMP9, TNF, CXCL8, PTGS2, ALB, PIK3CG)。通过对这15个关键靶点进行KEGG、GO功能富集分析。通过Score排列最终筛选出前5个关键靶点与其对应的化合物进行分子对接测试蛋白与配体相互作用的可靠性。
主要涉及VEGF信号通路、Rap1信号通路、TNF信号通路、ErbB信号通路以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂等方面的15个关键靶点是通过KEGG分析得出的。GO的结果表明，我们所获得15个关键靶点主要参与了细胞运动的正向调节、上皮细胞的调节、细胞迁移、蛋白激酶B信号等生物学过程；基因主要定位在锚定连接、膜的侧面、细胞前缘、质膜的外源性成分等。根据文献资料，Rap1信号途径在众多关键的细胞活动中都有所体现，包括细胞的粘附、连接信息的传递与调节、细胞的迁移、极化，以及细胞的增长和生存[13] [14]。这些功能都依赖于细胞质内一种或多种信号转导蛋白。TNF信号途径在全身炎症反应中起到关键作用，它是急性期反应中的关键细胞因子之一。虽然主要是由激活的巨噬细胞生成的，但还有许多其他种类的细胞，例如CD4+淋巴细胞、NK细胞、嗜中性粒细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞以及神经元，也有能力生成TNF [15] [16]。这些细胞因子在急性炎症性疾病中起着非常重要的作用。TNF是由经典的促炎反应交联生成的，其中最具代表性的是激活NF-κB和c-Jun通路，这种激活会导致各种经典促炎细胞因子的表达[17]。ErbB受体的信号是通过Akt、MAPK和其他多个途径来调控细胞的增长、迁徙、分化、死亡和移动的，ErbB家族成员以及其部分配体通常过表达、扩增或突变，这使其成为重要的治疗靶标[18]。
血人参活性成分与关键靶点之间展现出优异的结合性能，分子对接分析结果证实了这一现象。Fisetin与关键靶点(EGFR、SRC、PIK3R1和PTK2)的结合性和亲和力都比较高，通过查阅文献Fisetin具有多种药理学益处，包括抗炎、抗凋亡、抗氧化、抗肿瘤和抗血管生成作用[19] [20]。Fisetin通过抑制Src介导的TNF信号通路和MAPK信号通路来缓解炎症和细胞凋亡[20]。Fisetin可能通过介导EGFR、SRC、PIK3R1和PTK2达到抗炎的效果，从而治疗肺痈。
5. 结论
本研究使用网络药理学从多成分、多靶点和多途径的角度阐述了血人参治疗肺痈的作用机制。综上所述，血人参在抗炎症上的成分及靶点均明确且有效，其发挥作用的主要成分为Fisetin、Phenyl acetate、2-Naphthylamine和(R)-mandelic Acid，其作用靶点为EGFR、SRC、PLCG1、PIK3R1、PTK2。
基金项目
贵州省省级科技计划项目(黔科合基础-ZK [2021]一般538)；贵州省教育厅青年人才成长项目(黔教技[2022] 206)；贵州省2023年大学生创新创业训练计划项目(S202310662011，贵中医大创合字(2023) 54号)。