摘要: 目的：探讨OX-2膜糖蛋白(CD200)对冠心病合并糖尿病患者体内慢性炎症的调控作用。方法：选取2023年3月~2024年3月在临沂市中心医院就诊的符合纳入标准的冠心病患者、糖尿病患者、冠心病合并糖尿病患者3组各20例共60例，ELISA法检测各组患者血清中CD200分子浓度，流式细胞术测定血清中白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)水平，对两组数据进行统计学分析比较，进而探究CD200对慢性炎症的抑制性调控作用。结果：冠心病患者、糖尿病患者、冠心病合并糖尿病患者3组数据均高于正常参考值(0~5.3 mmol/L)，冠心病合并糖尿病组IL-6 (16.53 ± 3.88 mmol/L)水平高于冠心病组IL-6 (13.91 ± 1.70 mmol/L)，差异有统计学意义(P < 0.01)；冠心病合并糖尿病组IL-6 (16.53 ± 3.88 mmol/L)水平高于糖尿病组IL-6 (15.70 ± 5.24 mmol/L)，差异有统计学意义(P < 0.01)，糖尿病组IL-6 (15.70 ± 5.24 mmol/L)水平高于冠心病组IL-6 (13.91 ± 1.70 mmol/L)，差异有统计学意义(P < 0.01)。冠心病组CD200分子浓度(1570.98 ± 231.31 mmol/L)高于冠心病合并糖尿病组CD200 (1052.09 ± 171.82 mmol/L)水平，差异有统计学意义(P < 0.01)；糖尿病组CD200分子浓度(1063.30 ± 186.56 mmol/L)高于冠心病合并糖尿病组CD200 (1052.09 ± 171.82 mmol/L)水平，差异有统计学意义(P < 0.01)；冠心病组CD200分子浓度(1570.98 ± 231.31 mmol/L)高于糖尿病组CD200分子浓度(1063.30 ± 186.56 mmol/L)，差异有统计学意义(P < 0.01)。Spearman相关分析提示，冠心病患者血清CD200分子浓度与IL-6分子浓度呈负相关(r = −0.95, P < 0.01)；糖尿病患者血清CD200分子浓度与IL-6分子浓度呈负相关(r = −0.91, P < 0.01)；冠心病合并糖尿病患者血清CD200分子浓度与IL-6分子浓度呈负相关(r = −0.91, P < 0.01)。3组患者血清CD200分子浓度均与IL-6分子浓度呈负相关(r = −0.69, P < 0.01)。结论：CD200对IL-6起到抑制性调控作用，能够有效控制炎症，进而缓解动脉粥样硬化的病理发展进程。针对CD200的研究为临床治疗冠心病合并糖尿病患者提供新的策略。并预测开发针对CD200-CD200R轴的激动剂有望延缓冠心病合并糖尿病患者的疾病进展。
Abstract: Objective: To explore the regulatory effect of OX-2 membrane glycoprotein (CD200) on chronic inflammation in patients with coronary heart disease (CHD) complicated with diabetes mellitus (DM). Methods: A total of 60 patients were enrolled in this study, including 20 patients with CHD, 20 patients with DM, and 20 patients with CHD complicated with DM, all of whom met the inclusion criteria. The concentration of CD200 molecules in the serum of each group was determined by ELISA, and the level of IL-6 in the serum was measured by flow cytometry. The two sets of data were analyzed and compared to investigate the inhibitory regulatory effect of CD200 on chronic inflammation. Results: The data from the three groups of patients with coronary heart disease (CHD), diabetes mellitus (DM), and CHD complicated with DM were all higher than the normal reference values (0~5.3 mmol/L). The level of IL-6 in the CHD complicated with DM group (16.53 ± 3.88 mmol/L) was significantly higher than that in the CHD group (13.91 ± 1.70 mmol/L), with a statistically significant difference (P < 0.01). The level of IL-6 in the CHD complicated with DM group (16.53 ± 3.88 mmol/L) was also significantly higher than that in the DM group (15.70 ± 5.24 mmol/L), with a statistically significant difference (P < 0.01). Moreover, the level of IL-6 in the DM group (15.70 ± 5.24 mmol/L) was significantly higher than that in the CHD group (13.91 ± 1.70 mmol/L), also with a statistically significant difference (P < 0.01). The concentration of CD200 molecules in the CHD group (1570.98 ± 231.31 mmol/L) was significantly higher than that in the CHD complicated with DM group (1052.09 ± 171.82 mmol/L), with a statistically significant difference (P < 0.01). The molecular concentration of CD200 in the diabetic group (1063.30 ± 186.56 mmol/L) was higher than that in coronary heart disease complicated with diabetes (1052.09 ± 171.82 mmol/L), there was a significant difference (P < 0.01). The concentration of CD200 molecules in the CHD group (1570.98 ± 231.31 mmol/L) was significantly higher than that in the DM group (1063.30 ± 186.56 mmol/L), with a statistically significant difference (P < 0.01). Spearman correlation analysis revealed a negative correlation between the serum CD200 molecule concentration and IL-6 molecule concentration in patients with CHD (r = −0.95, P < 0.01); Similarly, a negative correlation was observed between serum CD200 molecule concentration and IL-6 molecule concentration in patients with DM (r = −0.91, P < 0.01), as well as in patients with CHD complicated with DM (r = −0.91, P < 0.01). The serum CD200 molecule concentrations in all three patient groups showed a negative correlation with IL-6 molecule concentrations (r = −0.69, P < 0.01). Conclusion: CD200 exerts inhibitory regulatory effects on IL-6, effectively controlling inflammation and alleviating the pathological progression of atherosclerosis. Research on CD200 provides new strategies for the clinical treatment of patients with coronary heart disease combined with diabetes. It is also predicted that the development of agonists targeting the CD200-CD200R axis is expected to delay disease progression in patients with coronary heart disease combined with diabetes.
1. 引言
动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是一种广泛存在于动脉壁的多灶性、浸润性、慢性免疫炎症性疾病。AS发病机制颇为复杂，其中，炎症在其起始、进展及各个病理阶段都发挥了重要作用。动脉粥样硬化的一大特征在于，其病理过程始于动脉内膜的损伤，并累及整个动脉结构。AS起始于脂质在动脉壁的积聚，继而导致内皮功能障碍，进而触发循环免疫细胞的迁移与聚集。在这一过程中，循环中的单核细胞首先会粘附于动脉壁的损伤区域，随后渗透入内并分化为巨噬细胞，巨噬细胞通过吞噬机制摄取脂质，逐渐转化为泡沫细胞，最终促进了脂肪条纹的形成。随着这一过程的推进，基质金属蛋白酶被激活，导致胶原降解，同时血管平滑肌细胞和内皮细胞发生迁移和增殖，直至动脉粥样硬化斑块的形成[1]。AS发病机制复杂，目前普遍认为，炎症在其发生发展的各个阶段都发挥了重要作用[2]。动脉粥样硬化以动脉壁内膜层的损伤和斑块的积聚为显著表现，当其累及冠状动脉，就引发了冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary atherosclerotic heart disease, CAD)的发生。
糖尿病(diabetes mellitus, DM)是CAD的一个重要合并疾病。一项涵盖102个前瞻性研究的荟萃分析结果揭示，糖尿病患者罹患冠心病的风险相较于无糖尿病成年人高出2~3倍[3]。CAD仍然是糖尿病患者死亡的主要原因之一。特别是在2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus, T2DM)患者中，与无糖尿病的个体相比，CAD通常早发生14.6年，并且病情更为严重，分布更为广泛[4]，冠心病合并糖尿病对患者的生命安全造成了极大的威胁。糖尿病患者存在的糖代谢紊乱、胰岛素抵抗及血脂紊乱状态，通过免疫炎症、氧化应激、蛋白质糖基化、内质网应激等一系列机制共同促进了CAD的发生发展。
CAD和DM共同特征之一是慢性炎症，CAD患者体内普遍存在慢性低度炎症状态。慢性炎症也是CAD的危险因素之一，它引发的氧化应激和加剧炎症反应，对血管内皮细胞造成损害，进而促进动脉粥样硬化的进程。而在DM患者中，血糖和游离脂肪酸水平的升高，可使炎性小体活性增加，并提升核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 (NOD-like receptor protein 3, NLRP3)与炎症趋化因子的水平[5]。此外，在DM患者体内，坏死性凋亡(NETosis)标记物水平也有所升高，NETosis是一种巨噬细胞死亡的特殊方式，已在动物模型中证实NETosis对CAD疾病进程发展中的潜在影响[6]。
OX-2膜糖蛋白(CD200)是一种在免疫细胞表面表达的糖蛋白，它可与CD200抑制性受体(CD200R)相结合，在动脉粥样硬化过程中发挥重要作用。CD200通过与CD200R的相互作用，激活细胞内的抑制性信号通路，招募RasGAP，从而抑制效应细胞的活性[7]，并抑制单核细胞的形成和募集，减少炎症过程中单核细胞和巨噬细胞的积累，从而稳定AS斑块，防止其破裂。白细胞介素-6 (interleukin, IL-6)是评价血清中炎症反应程度的重要指标，其在炎症反应和免疫应答过程中发挥着重要作用，它不仅对血管内皮细胞具有毒性效应，还深度参与炎性损伤过程，能够刺激细胞生长、促进细胞分化并加速急性期蛋白的合成[8]。并且IL-6水平升高可诱发体内多种炎症介质含量迅速上升，包括肿瘤坏死因子-α、IL-3等，进一步诱发炎症瀑布形成。Christina Kassiteridi团队的一项动物实验研究进一步表明，CD200-CD200R激活后通过抑制骨髓细胞中信号转导与转录激活因子1 (signal transducerand activator of transcription 1, STAT1)的磷酸化从而减少动脉粥样硬化病变过程中白细胞介素6 (Interleukin-6, IL-6)的产生[9]，最终起到控制炎症，缓解动脉粥样硬化进程的作用。本研究通过ELISA测定冠心病患者、糖尿病患者、冠心病合并糖尿病患者3组各20例共60例样本血清中CD200分子浓度，与流式细胞术测定的IL-6水平进行相关性分析，旨在探索CD200对炎症的抑制性调控作用。
2. 资料与方法
2.1. 临床资料
选取2023年3月~2024年3月在临沂市中心医院诊治的冠心病患者、糖尿病患者、冠心病合并糖尿病患者3组各20例共60例。纳入标准：经诊断为：糖尿病(中国2型糖尿病防治指南(2020年版)诊断标准)、冠心病(世界卫生组织(WHO)诊断标准)。排除标准1) 糖尿病急性代谢并发症的患者；2) 先天性心脏病的患者；3) 限制性或肥厚性心肌病的患者；4) 急性心律失常的患者；5) 严重瓣膜病变的患者；6) 自身免疫性疾病的患者；7) 严重肺疾病的患者；8) 肿瘤的患者；9) 高出血风险的患者；10) 严重心律失常的患者；11) 脑出血的患者；12) 肝、肾功损伤的患者；13) 入组前近3个月内参加过药物临床试验的患者；14) 经研究者判断，受试者有其他可能导致本研究被迫中途终止的因素，如其他的严重疾病(含精神疾病)需要合并治疗，有严重的实验室检查异常，伴有家庭或社会等因素，会影响到受试者的安全，或资料及样品的收集。本研究经过医院伦理委员会批准，患者自愿参加本研究，并签署知情同意书。3组年龄和性别构成比较：冠心病组男性9例，女性11例；年龄34~73岁，平均年龄(62.35 ± 11.98)岁；糖尿病组男性10例，女性10例；年龄42~75岁，平均年龄(66.40 ± 5.56)岁；冠心病合并糖尿病组男性11例，女性9例；年龄57~74岁，平均年龄(64.4 ± 9.47)岁。各组间年龄、性别差异无统计学意义(P > 0.05)，具有可比性。
2.2. 方法
取研究对象入院时晨空腹静脉血样，流式细胞术检测外周血清中IL-6水平。取研究对象晨空腹静脉血样，将收集于血清分离管的全血标本在室温放置0.5小时，离心机1000Xg离心20分钟，将上清置于−80℃冰箱保存待用，用纯化的人CD200分子抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入CD200分子，再与辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)标记的CD200分子抗体结合，形成抗体–抗原–酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine, TMB)显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的CD200分子呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中人CD200分子浓度。
2.3. 统计学方法
通过SPSS 27.0软件进行处理，数据以(
)表示，多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，P < 0.05表示差异具有统计学意义。Pearson相关分析评估各样本IL-6水平与CD200分子浓度之间的相关性。
3. 结果
3.1. 3组血清IL-6分子浓度比较
冠心病患者、糖尿病患者、冠心病合并糖尿病患者3组数据均高于正常参考值(0~5.3 mmol/L)，冠心病合并糖尿病组IL-6 (16.53 ± 3.88 mmol/L)水平高于冠心病组IL-6 (13.91 ± 1.70 mmol/L)，差异有统计学意义(P < 0.01)；冠心病合并糖尿病组IL-6 (16.53 ± 3.88 mmol/L)水平高于糖尿病组IL-6 (15.70 ± 5.24 mmol/L)，差异有统计学意义(P < 0.01)，糖尿病组IL-6 (15.70 ± 5.24 mmol/L)水平高于冠心病组IL-6 (13.91 ± 1.70 mmol/L)，差异有统计学意义(P < 0.01)。
3.2. 3组血清CD200分子浓度比较
冠心病组CD200分子浓度(1570.98 ± 231.31 mmol/L)高于冠心病合并糖尿病组CD200 (1052.09 ± 171.82 mmol/L)水平，差异有统计学意义(P < 0.01)；糖尿病组CD200分子浓度(1063.30 ± 186.56 mmol/L) 高于冠心病合并糖尿病组CD200 (1052.09 ± 171.82 mmol/L)水平，差异有统计学意义(P < 0.01)；冠心病组CD200分子浓度(1570.98 ± 231.31 mmol/L)高于糖尿病组CD200分子浓度(1063.30 ± 186.56 mmol/L)，差异有统计学意义(P < 0.01)。
3.3. 3组血清CD200分子浓度与IL-6分子浓度相关性分析
Spearman相关分析提示，冠心病患者血清CD200分子浓度与IL-6分子浓度呈负相关(r = −0.95, P < 0.01)；糖尿病患者血清CD200分子浓度与IL-6分子浓度呈负相关(r = −0.91, P < 0.01)；冠心病合并糖尿病患者血清CD200分子浓度与IL-6分子浓度呈负相关(r = −0.91, P < 0.01)。3组患者血清CD200分子浓度均与IL-6分子浓度呈负相关(r = −0.69, P < 0.01)。
4. 讨论
CAD患者体内为慢性低度炎症状态。慢性炎症也是CAD的危险因素之一，慢性炎症可通过氧化应激和炎症反应，损伤血管内皮细胞，促进动脉粥样硬化的进程[10]。DM是CAD的重要合并疾病，慢性炎症是CAD和DM共同特征。近年来越来越多的研究支持DM慢性炎症状态的假说，认为DM可能是细胞因子介导的炎性反应[11]，IL-6参与炎性损伤过程，具有刺激细胞生长、促进细胞分化和加速细胞急性期蛋白合成的作用，在炎症反应和免疫应答过程中发挥重要作用。本研究发现，冠心病患者、糖尿病患者、冠心病合并糖尿病患者血清中IL-6水平均高于正常值，且冠心病合并糖尿病组患者血清中IL-6水平高于冠心病组及糖尿病组，表明IL-6在冠心病及糖尿病的疾病进程中起着重要的作用，且两种疾病状态下炎症反应的叠加效应加剧了冠心病合并糖尿病的疾病恶化。
CD200是一种在免疫细胞上表达的糖蛋白，它可与CD200R结合，通过抑制单核细胞的形成和募集，进而减少炎症过程中单核细胞和巨噬细胞的积累。近期研究发现，CD200与CD200R结合后，可以减少动脉粥样硬化病变过程中IL-6的产生[9]，起到缓解动脉粥样硬化进程的作用。本研究发现，3组患者血清中CD200分子浓度与IL-6分子浓度均呈负相关，这与Christina Kassiteridi团队的动物实验研究结果相符，以上发现，验证了CD200对炎症的抑制性调控作用，为临床治疗冠心病合并糖尿病患者提供新的策略。并预测开发针对CD200-CD200R轴的激动剂有望延缓冠心病合并糖尿病患者的疾病发展。
NOTES
*通讯作者。