基于生物信息学探索山豆根治疗肝硬化的作用机制与物质基础

To Explore the Mechanism of Action and Material Basis of Sophora tonkinensis Gagnep in the Treatment of Liver Cirrhosis Based on Bioinformatics

摘要: 目的：基于生物信息学探索山豆根治疗肝硬化的作用机制与物质基础。方法：前期研究获取山豆根的活性成分。利用SuperPred数据库筛选出山豆根化学成分的潜在作用靶点；通过GeneCards、DrugBank、OMIM和CTD等数据库获取肝硬化的潜在作用靶点；进而用Venny 2.1.0对山豆根化学成分潜在靶点及肝硬化的潜在靶点进行交集分析；运用String平台构建蛋白互作网络图(PPI)导入到Cytoscape软件构建“中药–活性成分–疾病靶点–疾病”调控网络图以及筛选出核心靶点；通过metoscape数据库对交集靶点进行基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析以及筛选出山豆根治疗肝硬化的核心成分；最后，通过CB-DOCK2软件将山豆根治疗肝硬化的核心靶点与核心成分进行分子对接。结果：实验筛选得到对肝硬化有潜在治疗作用的85个有效活性成分以及46个交集靶点，核心靶点主要包括HIF1A、肿瘤坏死因子(TNF-a)、环氧合酶2 (PTGS2)、MAPK1等。GO富集分析涉及基因表达的正向调控、老化、细胞凋亡过程的正向调节等生物过程。KEGG通路分析显示山豆根主要影响癌症的通路、IL-17信号通路、细胞凋亡、脂质和动脉粥样硬化等信号通路。结论：应用生物信息学的方法预测出山豆根治疗肝硬化的作用机制以及物质基础，为其进一步研究提供新的思路与线索。

Abstract: Objective: To explore the mechanism of action and material basis of Sophora tonkinensis Gagnep in treating liver cirrhosis based on bioinformatics. Method: Screening the potential targets of chemical constituents of Sophora tonkinensis Gagnep by SuperPred database; Obtain the potential targets of liver cirrhosis through GeneCards, DrugBank, OMIM and CTD databases; Venny 2.1. 0 was used to analyze the potential targets of chemical composition of Sophora tonkinensis Gagnep and the potential targets of liver cirrhosis; Using String platform to construct protein interaction network diagram (PPI) and import it into Cytoscape software to construct “traditional Chinese medicine-active ingredients-disease target-disease” regulatory network diagram and screen out core targets; Through metoscape database, gene ontology (GO) function enrichment analysis and Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome (KEGG) pathway enrichment analysis were carried out on the intersection targets, and the core components of Sophora tonkinensis Gagnep in treating liver cirrhosis were screened out. Finally, the core target of Sophora tonkinensis Gagnep in treating liver cirrhosis was docked with the core component by CB-DOCK2 software. Results: The experiment screened out 85 active ingredients with potential therapeutic effects on cirrhosis, as well as 46 intersection targets. The core targets mainly include HIF1A, tumor necrosis factor (TNF-a), cyclooxygenase 2 (PTGS2), MAPK1, etc. GO enrichment analysis involves positive regulation of gene expression, aging, and positive regulation of the cell apoptosis process in biological processes. KEGG pathway analysis shows that Sophora Tonkinensis Gagnep mainly affects cancer pathways, IL-17 signaling pathways, cell apoptosis, lipids, atherosclerosis and other signaling pathways. Conclusion: The application of bioinformatics methods has predicted the mechanism of action and material basis of Sophora tonkinensis Gagnep in treating liver cirrhosis, providing new ideas and clues for its further research.

1. 引言

肝硬化(Cirrhosis)是一种或多种慢性肝病长期反复发展，导致肝脏炎症、持续纤维化、假小叶、再生结节以及血管增殖为主要病理特征，并且持续恶化而形成的一种疾病[1]。肝纤维化是慢性肝病发展为肝硬化的必经之路，其中肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的活化，细胞外基质(extracellular matrixc, ECM)在肝脏中过多沉积是形成肝纤维化主要机制[2]。肝硬化是全球慢性肝病患者发病和死亡的重要原因[3]。全球肝病相关死亡率评估，肝硬化每年导致116万人死亡，居全球常见死亡原因的第11位[4]。至目前为止，我国肝硬化患者约700万，给患者家庭和社会造成了严重的疾病负担和经济负担。肝硬化在中医称为“胁痛”、“积聚”、“鼓胀”等，一般认为，早期肝硬化属中医的胁痛、积聚范畴，晚期属鼓胀范畴[5]。《兰室秘藏》也提出：鼓胀病皆由脾胃之气虚弱不能运化精微，聚而不散而成胀满。

山豆根(Sophora tonkinensis Gagnep)为豆科植物越南槐的干燥根和根茎，其主要分布在中国东南部和中南部以及越南[5]，归肺、胃经，具有清热解毒的功效[6] [7]，《开宝本草》中记载山豆根可治疗湿热黄疸，本课题组前期研究发现山豆根中含有柚皮苷、柚皮芸香苷、槲皮素等147种化学成分，具有抗炎、抗乙肝病毒、保肝等药理作用[8] [9]。

利用生物信息学能够探索山豆根活性成分治疗肝硬化的作用及机制，中药具有多成分、多靶点、多通路的特点，药物分子作用于单一靶点或信号通路的研究难以揭示其科学内涵。生物信息学从相互关联的角度研究问题，从整体水平上研究药物的作用及机制，为中药复杂作用规律提供新的思路[10]。基于生物信息学方法探讨山豆根的药效成分及其潜在作用靶点[11]，从整体的角度探索中药与疾病之间的关联性，具有整体性、与中医药整体观与辨证论治的原则不谋而合[12]，为进一步研究山豆根治疗肝硬化的作用机制提供新的思路与方法。

2. 资料与方法

2.1. 山豆根有效成分及靶点的获取

通过液相色谱–质谱联用技术(LC-MS)共获得山豆根的147个成分(见表1)。运用Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获取山豆根有效成分smiles号，接着将获取的选取的smiles号输入到superprediction数据库(https://www.rcsb.org/)中进行山豆根靶点的预测选取可信度 ≥ 98%的靶点以及已知的靶点；对靶点进行合并、去重，利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org) [13]，限定物种为“Homo sapiens”，收集山豆根活性成分对应靶点的基因名。

Table 1. LC-MS technology obtains the active ingredients of Sophora tonkinensis Gagnep

表1. LC-MS技术获得山豆根活性成分

No.	Compound Name
1	5-hydroxymethyl-2-furaldehyde
2	L(+)-arginine
3	D-(+)-glucose
4	(-)-quinic acid
5	sucrose
6	D-gluconic acid
7	DL-malic acid
8	melezitose
9	cytosine
10	stachydrine
11	cytidine
12	adenine
13	ecgonine
14	citric acid
15	nicotinic acid
16	D-(-)-citramalic acid
17	cytisine
18	uridine

续表

19	DL-O-tyrosine
20	9α-hydroxysophocarpine
21	guanosine
22	2-hydroxy-6-aminopurine
23	sophoranol
24	N-gulcytisine
25	3-hydroxy-3-methylglutaric acid
26	L-isoleucine
27	9α-hydroxymatrine
28	gallic acid
29	thermopsine
30	allomatrine
31	caffeic acid
32	2-amino-L-phenylethanol
33	phenprobamate
34	sophocarpine
35	N-formylcytisine
36	4-hydroxyphenylpyruvic acid
37	2-(2-hydroxyethoxy)phenol
38	7,8-dihydroxy-4-methylcoumarin
39	pantothenic acid
40	14α-acetoxymatrine
41	oxymatrine
42	(8r)-3-(4-hydroxyphenyl)-L-propanol-2-O-β-D-glucopyranoside
43	maltol
44	5α-hydroxylemannine
45	N-acetyl-5-hydroxytryptamine
46	D-(+)-tryptophan
47	1,5-diaminonaphthalene
48	3-indoleacrylic acid
49	L-tryptophan
50	3,4-dihydroxybenzaldehyde
51	N-acetylcytisine
52	daidzein-4,7-diglucoside
53	(e)-4-hydroxycinnamylalcohol4-O-[2'-O--D-apiofuranosyl(1''2')]--D-glucopyranoside
54	coniferin

续表

55	Val-Ile
56	kalopanaxin D
57	3-hydroxybenzyl alcohol
58	1,6-dihydroxynaphthalene
59	1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid
60	9α,14β-dihydroxymatrine
61	5α,14β-dihydroxymatrine
62	N-propionylcytisine
63	4-hydroxybenzaldehyde
64	isomangiferin
65	esculetin
66	puerarin
67	naringin
68	kushenol O
69	puerarin apioside
70	quercitrin
71	naringin dihydrochalcone
72	syringin
73	(6S,9R)-roseoside
74	geraldol
75	daidzin
76	daidzein-4'-glucoside-rhamnoside
77	cinnamic acid
78	coniferyl alcohol
79	kaempferol-7-O-neohesperidoside
80	pinoresinol diglucoside
81	sinapyl alcohol
82	pinoresinol-4,4'-di-O-β-D-glucopyranoside
83	erybraedin D
84	glycitin
85	3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid
86	secoisolariciresinol-4-O-β-D-glucopyranoside
87	syringaresinol-4,4'-di-O-β-D-glucopyranoside
88	vitexin-2''-O-rhamnoside
89	isovitexin
90	calycosin-7-O-β-D-glucoside

续表

91	spinosine
92	sophojaponicin
93	apigenin-7-O-β-D-glucoside
94	hydroxyecdysone
95	narirutin
96	syringaresinol-4-O-β-D-glucopyranoside
97	narcissoside
98	diosmin
99	azelaic acid
100	medioresinol
101	4',6-dimethoxyisoflavone-7-O-beta-D-glucopyranoside
102	(3s,4r)-4-hydroxy-7,4'-dimethoxyisoflavan3'-O-β-D-glucopyranoside
103	swertisin
104	lespeflorin B4
105	6-hydroxy-7-methoxy-4-phenylcoumarin
106	ononin
107	N-hexanoylcytisine
108	genistein-7-α-L-rhamnopyranosyl-β-D-glucopyranoside
109	(+)-abscisic acid
110	dimethylfraxetin
111	sebacic acid
112	3,5-dihydroxybenzyl alcohol
113	juglone
114	maackiaine
115	trifolirhizin
116	2,6-dihydroxy-4-methylbenzoic acid
117	syringaresinol
118	calycosin
119	6''-O-acetylglycitin
120	7,2'-dihydroxy-4'-methoxy-isoflavanol
121	(6aR,11aR)-3-O-β-D-glucopyranosylmedicarpin
122	4-anisaldehyde
123	trifolirhizin-6''-malonate
124	4-hydroperoxy-2-nonenal
125	subprogenin C
126	undecanedioic acid

续表

127	butesuperin B-7''-O-β-glucopyranoside
128	corosolic acid
129	ursolic acid
130	9-oxo-10e,12z,15z-octadecatrienoic acid
131	betulinic acid
132	maackiain-3-O-glucoside-6''-acetate
133	trifolirhizin 6'-monoacetate
134	soyasaponin Be
135	3,4-dimethoxycinnamic acid
136	dodecanedioic acid
137	3,4,5-trimethoxycinnamic acid
138	9-oxo-10(e),12(e)-octadecadienoic acid
139	4',6'-dimethoxy-2'-hydroxyacetophenone
140	lupenone
141	6-gingerol
142	12,13-dihydroxy-9z-octadecenoic acid
143	spiculisporic acid
144	oleamide
145	(-)-carveol
146	4-methylbenzyl alcohol
147	lupeol

2.2. 肝硬化的相关靶点的获取

以“cirrhosis”为关键词，分别从GeneCards数据库(https://www.genecards.org/) [14]、OMIM数据库(https://omim.org/) [15]、DrugBank数据库(https://www.drugbank.ca/) [16]、TTD数据库(http: //db.idrblab.net/ttd/)对肝硬化相关靶点进行搜索，合并去除重复基因后，收集相关的靶点，利用UniProt数据库将所得的肝硬化的疾病靶点的蛋白名转换为基因名。

2.3. 构建核心靶点蛋白质互作网络(PPI)

将疾病相关靶点和中药相关靶点导入venny2.1.0数据库[17]中得到交集靶点，将交集导入STRING (https://string-db.org/)，一个用于搜寻已知蛋白质之间和预测蛋白质之间相互作用的系统[18]，设置物种条件为人，将最低互作评分值设置为0.900，隐藏孤立蛋白，下载tsv文件，构建蛋白互作网络(PPI)。

2.4. 构建“中药-活性成分–疾病靶点–疾病”调控网络图

将交集靶点导入STRING数据库构建蛋白相互作用网络，将PPI网络导入Cytoscape软件，利用CytoNCA插件，获得Degree值[19]筛选出核心靶点，同时构建“中药–活性成分–疾病靶点–疾病”相互作用网络图。

2.5. 基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

为了研究山豆根治疗肝硬化的主要生物学过程及代谢通路，将山豆根与肝硬化的交集靶点导入metoscape数据库(https://metascape.org/)对获得的靶点进行GO富集分析和KEGG通路分析。选择生物过程(biological process, BP)、分子功能(molecular function, MF)和细胞组分(cellular component, CC)对山豆根治疗肝硬化的靶点进行GO生物过程富集分析。以q值对GO过程及KEGG通路进行功能排序，分别选取前10位用微生信软件(http://www.bioinformatics.com.cn)进行可视化分析，综合预测山豆根治疗肝硬化的分子作用机制。

将交集靶点导入metoscape数据库中筛选出中药治疗疾病的主要活性成分。

2.6. 分子对接

通过pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)获取化合物的SDF结构文件以及Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)获得受体的PDB结构文件，运用CB-DOCK2软件进行分子对接。

3. 结果

3.1. 山豆根有效成分筛选与靶点预测

通过液相色谱–质谱联用技术(LC-MS)共获得山豆根的147个成分，基于superpred数据库查找山豆根成分的作用靶点，选取已知靶点以及probably ≥ 98%的靶点，合并、去重得到47个靶点以及对肝硬化有潜在治疗作用的85个有效活性成分。

3.2. 肝硬化相关靶点预测

通过GeneCard数据库、OMIM数据库、CTD数据库、DrugBank数据库分别获得肝硬化相关靶基因，对获得的靶点数据进行合并、去重，经整理后共获得37,585个肝硬化相关靶基因；绘制韦恩图获得山豆根和肝硬化的交集靶点，即山豆根抗肝硬化的作用靶点(见图1)。

Figure 1. Intersection target of Sophora tonkinensis Gagnepand cirrhosis

图1. 山豆根和肝硬化的交集靶

3.3. “中药–活性成分–疾病靶点–疾病”相互作用网络图以及PPI分析

通过metoscape数据库筛选出山豆根治疗肝硬化的核心成分为柚皮苷(naringin)、柚皮芸香苷(narirutin)、槲皮苷(quercitrin)、山奈酚-7-O-新橘皮糖苷(kaempferol-7-O-neohesperidoside)、4,5-二羧基-γ-十五内酯(spiculisporic acid)，利用插件CytoNCA筛选度值大小获得山豆根治疗肝硬化的8个核心靶点为白细胞介素2 (interleukin 2, IL2)、HIF1A、肿瘤坏死因子(TNF)、环氧合酶2 (PTGS2)、MAPK1、MMP9、MTOR、TP53。在“中药–活性成分–疾病靶点–疾病”图中共有131个节点，其中来源于化合物的有85个，来源于基因的有46个(见图2)。

Figure 2. “Traditional Chinese medicine-active ingredient-disease target-disease” interaction network

图2.“中药–活性成分–疾病靶点–疾病”相互作用网络图

3.4. GO和KEGG富集分析

通过metoscape数据库中的GO分析得到GO条目224个，BP条目、CC条目和MF条目每个种类分别选取前10项进行可视化(见图3)，结果显示山豆根治疗肝硬化的靶点主要集中在基因表达的正向调控、老化、细胞凋亡过程的正向调节等生物过程，细胞质、质膜、核质等细胞组分，相同的蛋白质结合、锌离子结合、脱氧核糖核酸结合等分子功能。KEGG分析得到细胞信号通路98条，选择前10条通路作为山豆根治疗肝硬化的重要途径进行可视化(见图4)，结果表明，富集靶点较多的通路为IL-17信号通路、细胞凋亡、脂质和动脉粥样硬化通路，提示山豆根可能主要通过上述信号通路发挥抗肝硬化的作用。

3.5. 分子对接验证

活性成分与核心靶点的分子对接结果(见表2)。40对分子对接关系中，结合能 < −7.0 kcal∙mol⁻¹的共有25对(62.5%)，位于−7~−4 kcal∙mol⁻¹的有15对(37.5%)，即本研究预测出的核心靶点与潜在成分均有

Figure 3. GO enrichment analysis

图3. GO富集分析

Figure 4. Bubble plot of KEGG pathway enrichment analysis

图4. KEGG通路富集分析气泡图

Table 2. Docking results of active ingredients and potential target molecules

表2. 活性成分与潜在靶点分子对接结果

成分	MTOR	HIF1A	PTGS2	TP53	IL2	MMP9	MAPK1	TNF
naringin	−9.6	−8.4	−6.8	−8.7	−7	−9.5	−9.2	−7.7
spiculisporic acid	−6.1	−6.8	−4.4	−6.2	−5	−6.2	−6.9	−5.4
narirutin	−10.2	−8.8	−7.1	−8.6	−7.2	−9.7	−9.7	−7.9
quercitrin	−9.3	−8.6	−6.4	−6.6	−6.5	−8.4	−8	−7.1
kaempferol-7-O-neohesperidoside	−9.7	−8	−6.5	−8.6	−7.1	−9.2	−9	−7.8

较好的结合特性。

4. 讨论

本研究以生物信息分析学为基础，对山豆根抗肝硬化进行了分析，筛选出山豆根治疗肝硬化主要包括柚皮苷(naringin)、柚皮芸香苷(narirutin)、槲皮苷(quercitrin)、山奈酚-7-O-新橘皮糖苷(kaempferol-7-O-neohesperidoside)、4,5-二羧基-γ-十五内酯(spiculisporic acid) 5个活性成分。柚皮苷是一种具有抗氧化，抗纤维化，抗炎和抗癌特性的类黄酮，能够预防由不同药物引起的肝损害。柚皮苷能减少肝脏炎性细胞浸润[20]，防止肝星状细胞(HSC)的转分化，导致胶原蛋白合成减少，ECM合成和沉积大大降低，防止肝纤维化的发生[21]。槲皮苷可以通过水解反应转化为槲皮素。因此，槲皮苷可以被看作是槲皮素的衍生物。研究显示，槲皮素能调节MMP-9水平，抑制ECM的形成，从而发挥抗炎、抗纤维化作用[22]。此外，槲皮素能抑制巨噬细胞浸润、调控巨噬细胞极化、对炎症细胞因子具有较强的抑制作用，能有效减轻肝脏炎症和纤维化[23]。研究表明，槲皮素对肝硬化有一定的治疗作用，槲皮苷作为槲皮素的衍生物，对肝硬化的治疗作用还有待验证。

同时发现，山豆根可能通过作用于白细胞介素2(IL2)、HIF1A、肿瘤坏死因子(TNF-a)、环氧合酶2 (PTGS2)、MAPK1、MMP9、MTOR、TP53 8个核心靶点发挥治疗肝硬化的作用，PTGS29(环氧合酶2)参与了肝纤维化的主要发病机制，例如炎症、凋亡和细胞衰老，PTGS2也被称为环氧合酶2 (COX2)，是一种强效酶，是非甾体类药物的作用靶点之一，PTGS2参与了肝纤维化的主要发病机制，例如炎症、凋亡和细胞衰老。此外，在患有肝硬化的患者和动物模型中，PTGS2呈异常表达。这些发现表明，PTGS2过度表达引发炎症反应，导致肝纤维化的发生和发展；在肝纤维化的发展中具有广泛而关键的作用[24]，抑制PTGS2可降低肝脏炎性损伤[25]。TP53 (肿瘤蛋白p53)基因是人类一种重要的抑癌基因，位于17p13染色体区域，其编码的p53蛋白可抑制细胞周期、促进DNA修复，控制细胞的凋亡。常态时p53蛋白活性极低，而机体遭受刺激引起DNA损伤时，活化的p53通过调节下游靶基因的表达诱导细胞凋亡[26]。在肝纤维化发展过程中，p53蛋白表达显著上调，从而启动凋亡相关蛋白，使细胞凋亡，从而减缓肝纤维化的进程[27]。缺氧诱导因子1a (HIF1A)是一种转录因子，肝硬化或肝纤维化发生时肝组织处于缺血、缺氧状态，并伴有缺氧诱导因子1α (HIF-1α)表达增加[28] [29]。缺氧及其缺氧诱导因子能加速肝脏炎症、纤维化，甚至肿瘤的发生和发展。TNF-α (炎症)为一种致炎因子[30]，与肝坏死及肝纤维化程度密切相关，在肝硬化的发生发展中参与肝脏的损伤-修复循环，最终引起肝脏大量ECM的合成和沉积，从而导致肝纤维化或肝硬化。肝纤维化程度越明显，肝组织内TNF-α阳性细胞数越多，而正常肝组织中则无或仅有少量[31]。TNF-α水平高低可反映肝脏炎症程度[32]。IL-2 (炎症)是重要的抗炎因子和免疫调节因子，可激活细胞免疫，参与体内免疫应答反应，其表达水平随肝纤维化程度的加深增高，通过抑制肝内炎症发展和调节免疫功能来发挥其抗肝纤维化作用[31]。Napoli T等[33]研究表明，在肝硬化晚期甚至在肝移植前期用糖皮质激素治疗时，lL-2表达水平仍上升。MAPK1/ERK2/ERK作为丝裂原蛋白活化激酶(MAPK)家族成员之一，其主要功能包括调节细胞增殖、分化及死亡，MAPK1基因表达上调促进肝纤维化的发生[34] [35]，mTOR (凋亡)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在感受营养信号、调节细胞生长与增殖中起着关键性的作用[36]。肝星状细胞(HSC)是肌成纤维细胞的主要来源，mTOR过度激活导致肝脏中肌成纤维细胞蓄积增加，抑制活化HSC凋亡，从而促进纤维化进展[37]。

综上，本研究结果表明山豆根对肝硬化的治疗涉及柚皮苷(naringin)、柚皮芸香苷(narirutin)、槲皮苷(quercitrin)等活性成分以及白细胞介素2 (IL2)、HIF1A、肿瘤坏死因子(TNF)、环氧合酶2 (PTGS2)、MAPK1等靶标，本研究基于生物信息学探讨山豆根治疗肝硬化作用机制，阐述了多成分、多靶点间的复杂网络相互作用关系，为进一步开展动物模型实验提供了理论依据。

基金项目

国家自然科学基金项目(81960749)。

NOTES

^*通讯作者。