四妙汤对RA模型大鼠关节VDR、CYP27B1、CYP24A1、Foxp3、RORγt的影响

Effect of Simiao Decoction on VDR, CYP27B1, CYP24A1, Foxp3 and RORγt in the Joints of RA Model Rats

摘要: 目的：探讨四妙汤改善类风湿关节炎(RA)模型大鼠的作用机制。方法：采用胶原诱导法(CIA)建立RA模型大鼠，灌胃四妙汤水煎液低、中、高剂量组(3.15 g/kg、6.3 g/kg、12.6 g/kg)，维生素D组(25 μg/kg)。给药周期为28天，记录大鼠一般情况。苏木精–伊红(HE)染色法观察踝关节组织病理改变；酶联免疫吸附剂检测法(ELISA)检测大鼠血清白细胞介素-17 (IL-17)、白细胞介素-10 (IL-10)、转化生长因子-β (TGF-β)含量；实时荧光定量PCR法(RT-PCR)检测大鼠关节滑膜组织中维生素D受体(VDR)、1-α羟化酶(CYP27B1)、24-羟化酶(CYP24A1)、叉头/翼状螺旋转录因子3 (Foxp3)、维甲酸相关孤儿核受体γt (RORγt) mRNA表达。结果：与空白组相比，模型组血清IL-17含量水平显著上升(P < 0.05)，血清IL-10、TGF-β含量水平显著下降(P < 0.05)；关节滑膜CYP24A1、RORγt mRNA表达水平显著上升(P < 0.05)，VDR、CYP27B1、Foxp3 mRNA表达水平显著下降(P < 0.05)。与模型组相比，维生素D组及四妙汤高剂量组血清IL-17水平显著下降(P < 0.05)，维生素D组及四妙汤中、高剂量组血清IL-10水平显著上升(P < 0.05)，维生素D组及四妙汤高剂量组血清TGF-β水平显著上升(P < 0.05)；维生素D组及四妙汤中、高剂量组关节滑膜VDR、CYP27B1、Foxp3 mRNA表达水平显著上升(P < 0.05)，维生素D组及四妙汤低、中、高剂量组关节滑膜CYP24A1 mRNA表达水平显著下降(P < 0.05)，维生素D组及四妙汤中、高剂量组关节滑膜RORγt mRNA表达水平显著下降(P < 0.05)。结论：四妙汤通过调节关节滑膜组织中VDR、CYP27B1、CYP24A1、Foxp3、RORγt mRNA表达情况，改善血清IL-17、IL-10、TGF-β水平，发挥其干预RA的作用。

Abstract: Objective: To explore the mechanism of action of Simiao decoction in improving the rat model of RA. Methods: Rat models of rheumatoid arthritis (RA) were established by collagen-induced arthritis (CIA). The rats were then administered with low, medium and high doses of Simiao decoction (3.15 g/kg, 6.3 g/kg, 12.6 g/kg) and vitamin D (25 ng/kg) by gavage. The administration period was 28 days, and the general conditions of the rats were recorded. Observation of pathological changes in ankle joint tissues by hematoxylin-eosin (HE) staining method. The contents of interleukin-17 (IL-17), interleukin-10 (IL-10), and transforming growth factor-β (TGF-β) in the serum of rats were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The mRNA expressions of VDR, CYP27B1, CYP24A1, Foxp3, and RORγt in the synovial tissue of rat joints were detected by real-time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR). Results: Compared with the control group, the serum IL-17 content level in the model group significantly increased (P < 0.05), while the serum IL-10 and TGF-β content levels significantly decreased (P < 0.05); the mRNA expression levels of CYP24A1 and RORγt in the synovial membrane significantly increased (P < 0.05), and the mRNA expression levels of VDR, CYP27B1, and Foxp3 significantly decreased (P < 0.05). Compared with the model group, the serum IL-17 level in the vitamin D group and the high-dose Simiao decoction group significantly decreased (P < 0.05), the serum IL-10 level in the vitamin D group and the medium and high-dose Simiao decoction groups significantly increased (P < 0.05), and the serum TGF-β level in the vitamin D group and the high-dose Simiao decoction group significantly increased (P < 0.05); the mRNA expression levels of VDR, CYP27B1, and Foxp3 in the synovial membrane in the vitamin D group and the medium and high-dose Simiao decoction groups significantly increased (P < 0.05), the mRNA expression level of CYP24A1 in the synovial membrane in the vitamin D group and the low, medium, and high-dose Simiao decoction groups significantly decreased (P < 0.05), and the mRNA expression level of RORγt in the synovial membrane in the vitamin D group and the medium- and high-dose Simiao decoction groups significantly decreased (P < 0.05). Conclusion: Simiao decoction exerts its intervention effect on RA by regulating the mRNA expression of VDR, CYP27B1, CYP24A1, Foxp3, and RORγt in the synovial membrane and improving the levels of serum IL-17, IL-10, and TGF-β.

1. 引言

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是以滑膜炎症、关节软骨和骨破坏为主要病理改变的慢性自身免疫性疾病，主要影响手、足的外周关节，往往导致关节畸形、功能丧失，严重影响患者生活质量。RA发病因素受遗传、环境、免疫紊乱、细胞因子等多方面影响，作用机制复杂[1]，现有的临床治疗药物，无法有效控制病情发展，因此探索RA发病机制，研发有效的治疗药物对于保障我国居民健康具有重要意义。维生素D是人体必需的脂溶性维生素，对机体的免疫细胞具有调控作用，其免疫调节作用在RA的发病机制中有重要作用[2]，临床常给予RA患者补充维生素D以抑制免疫系统的紊乱[3]。因此，本实验选择以胶原诱导法CIA制备RA大鼠模型，观察四妙汤对RA大鼠血清IL-17、IL-10、TGF-β及关节滑膜VDR、CYP27B1、CYP24A1、Foxp3、RORγt mRNA表达的影响，进而探究四妙汤对干预治疗RA的作用机制。

2. 材料与仪器

2.1. 实验动物

7周龄SD雌性大鼠60只，SPF级，体质量200~220 g，购自贵州中医药大学实验动物研究所，许可证号：SCXK (黔) 2021-0003。本实验通过动物伦理审查(编号：20210100)。

2.2. 实验试剂

四妙汤水煎剂由黄芪(批号：20210503)、金银花(批号：20210763)、当归(批号：20210609)、甘草(批号：20210921)按照10:8:2:1配伍比例组成，均购自北京同仁堂贵阳药店，经贵州中医药大学方药教研室蒋志滨副教授鉴定为合格。4味药材放置于蒸馏水浸泡1 h，武火煮沸后改文火煎煮30 min，取滤液，二次煎煮后合并滤液，浓缩滤液至生药浓度0.63 g/ml。维生素D (批号：2104191，青岛双鲸药业股份有限公司)；甲氨蝶呤片(批号：036210906，上海上药信谊药厂有限公司)；牛II型胶原蛋白(货号：L22S11C125306，上海源叶生物科技有限公司)；弗氏不完全佐剂(批号：SLCH4885，美国SIGMA公司)；大鼠白细胞介素17 (IL-17)、大鼠白细胞介素10 (IL-10)、转化生长因子-β (TGF-β) ELISA试剂盒(批号：ML-E-23760、ML-E-23836、ML-E-23199，东莞市酶联生物有限公司)；HiScript^® II Q Select RT SuperMix for qPCR (批号：R233，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；2*Q3 SYBR qPCR Master Mix (批号：22204，上海吐露港生物科技有限公司)。

2.3. 主要实验仪器

样品组织研磨仪(上海净信公司)；台式高速冷冻离心机(湖南可成仪器)；磁力加热搅拌器(上海梅香仪器)；凝胶成像分析仪(北京久一仪器)；mμlISKANMK3型酶标仪(美国Thermo公司)，L500-A型离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

3. 方法

3.1. 分组与模型建立

将60只SD雌性大鼠适应性喂养1周后，随机分为空白组、模型组、维生素D组、四妙汤低、中、高剂量组，每组10只。参考文献所载方法将牛II型胶原蛋白与弗氏不完全佐剂1:1比例混合制成胶原乳液。于大鼠背部、尾根部及双足皮下各注射胶原乳液0.1 ml进行初次免疫，初次免疫7 d后，于大鼠背部及尾根部皮下各注射0.1 ml乳液加强免疫。造模结束后，四妙汤低、中、高剂量组分别给予四妙汤水煎液3.15 g/kg、6.3 g/kg、12.6 g/kg灌胃，维生素D组给予维生素D滴剂25 μg/kg，空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃，连续给药干预28 d，每日1次。

3.2. 标本采集

实验结束后，禁食12 h，用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，取腹主动脉血，4℃离心机离心10 min，取上清置冰箱备用。摘取大鼠关节，−80℃低温保存。

3.3. HE染色观察踝关节病理变化

按照HE染色法操作规范，取4%多聚甲醛固定的关节组织，经组织脱钙、脱水、包埋、切片；石蜡切片经脱蜡、染色、盐酸精分化、氨水返蓝、梯度脱水、封片，光学显微镜观察病理改变。

3.4. ELISA检测大鼠血清IL-17、IL-10、TGF-β水平

取−80℃冰箱保存的血清样本于冰上解冻，室温条件下平衡试剂盒，在酶标板内加样、加酶、温育、显色、终止、测定，最终检测出血清中IL-17、IL-10、TGF-β含量。

3.5. RT-PCR法检测大鼠关节滑膜VDR、CYP27B1、CYP24A1、Foxp3、RORγt mRNA表达的影响

采用Trizol法提取关节滑膜总RNA，取−80℃冰箱保存的重量约为100 mg的关节组织，加入1 ml Trizol试剂进行裂解，取2 μl溶解后的RNA溶液用微量分光光度计测定OD₂₆₀/OD₂₈₀值，估测RNA质量。配制逆转录反应体系，设置条件为50℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃ 10 min，将总RNA逆转为cDNA。引物由武汉擎科公司设计，序列见表1。以GAPDH为内参基因进行实时荧光定量PCR扩增检测关节组织样本，通过2^−ΔΔCt计算方法，分析VDR、CYP27B1、CYP24A1、Foxp3、RORγt mRNA的相对含量。

Table 1. Primer sequence table

表1. 引物序列表

名称	引物	序列	尺寸/bp
Rat GAPDH	Forward	5’-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3’	253 bp
	Reverse	5’-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3’
Rat CYP27B1	Forward	5’-CCCAGCTACCCCTGCTAAAG-3’	292 bp
	Reverse	5’-TCTGCCAAGCGTCTCCCTAT-3’
Rat CYP24A1	Forward	5’-GAAGGACAGGAGTGGCAAAG-3’	204 bp
	Reverse	5’-CACAAGGCAGATGCTTTCAA-3’
Rat Foxp3	Forward	5’-GAGGACACTCAATGAAATCTACCA-3’	309 bp
	Reverse	5’-CAAATTCATCTACGGTCCACACTG-3’
Rat RORγt	Forward	5’-GAGGCCATTCAGTACGTGGT-3’	352 bp
	Reverse	5’-GCAGATGCTCCACTCTCCTC-3’
Rat VDR	Forward	5’-ACAACAGCACATCATAGCCA-3’	250 bp
	Reverse	5’-GTCATCAGAATCCTCTCCGT-3’

3.6. 统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析，所有计量资料用($\overline{x}\pm s$ )表示，分组资料采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t分析，P < 0.05表示结果具有统计学差异。

4. 结果

4.1. 对RA模型大鼠踝关节组织病理改变的影响

HE病理切片显示，空白组踝关节组织软骨结构完整，滑膜结构清晰完整，衬里层由单层或双层滑膜细胞组成，未见病理改变。与空白组相比，模型组关节见不同程度纤维组织增生，衬里下层大量炎性细胞浸润，以核呈圆形深染的淋巴细胞为主；维生素D组、四妙汤低、中剂量组关节组织病理状态与模型组相比均有改善，炎性细胞减少，成纤维细胞增多，四妙汤高剂量组与模型组相比关节新生毛细血管形成，病理状态明显改善。如图1所示。

Figure 1. Effect of Simiao Decoction on joint morphology of RA model rats (HE, 100×)

图1. 四妙汤对RA模型大鼠关节组织形态的影响(HE, 100×)

4.2. 对RA模型大鼠血清IL-17、IL-10、TGF-β含量的影响

与空白组相比，模型组血清IL-17表达显著上升(P < 0.05)，IL-10、TGF-β表达显著降低(P < 0.05)；与模型组相比，维生素D组、四妙汤高剂量组血清IL-17表达显著降低(P < 0.05)，TGF-β表达显著上升(P < 0.05)；与模型组相比，维生素D组、四妙汤中、高剂量组血清IL-10表达显著上升(P < 0.05)。见表2。

Table 2. Serum levels of IL-17, IL-10 and TGF-β in each group ($\overline{x}\pm s$ )

表2. 各组大鼠血清IL-17、IL-10、TGF-β水平($\overline{x}\pm s$ )

组别	IL-17 (pg/mL)	IL-10 (pg/mL)	TGF-β (pg/mL)
空白组	20.23 ± 6.77	48.71 ± 9.75	199.82 ± 42.61
模型组	34.46 ± 4.94^a	22.71 ± 9.46^a	119.01 ± 32.16^a
维生素D组	27.19 ± 5.67^b	44.02 ± 5.44^b	169.01 ± 32.85^b
四妙汤低剂量组	35.16 ± 8.06	26.16 ± 3.57	140.05 ± 30.67
四妙汤中剂量组	34.97 ± 3.97	38.53 ± 7.44^b	153.67 ± 34.81
四妙汤高剂量组	27.84 ± 6.76^b	47.01 ± 6.95^b	175.16 ± 22.09^b
P值	<0.05	<0.05	<0.05

注：a表示与空白组相比P < 0.05，b表示与模型组相比P < 0.05，n = 6。

4.3. 对RA模型大鼠关节滑膜组织中VDR、CYP27B1、CYP24A1、Foxp3、RORγt mRNA

与空白组相比，模型组关节滑膜VDR、CYP27B1、Foxp3 mRNA表达水平显著下降(P < 0.05)，CYP24A1、RORγt mRNA表达水平显著上升(P < 0.05)；与模型组相比，维生素D组及四妙汤中、高剂量组关节滑膜VDR、CYP27B1、Foxp3 mRNA表达水平显著上升(P < 0.05)，维生素D组及四妙汤低、中、高剂量组关节滑膜CYP24A1 mRNA表达水平显著下降(P < 0.05)，维生素D组及四妙汤中、高剂量组关节滑膜RORγt mRNA表达水平显著下降(P < 0.05)。见表3。

Table 3. Relative expressions of VDR, CYP27B1, CYP24A1, Foxp3 and RORγt mRNA in joints of rats in each group

表3. 各组大鼠关节VDR、CYP27B1、CYP24A1、Foxp3、RORγt mRNA相对表达量

组别	VDR	CYP27B1	CYP24A1	Foxp3	RORγt
空白组	0.99 ± 0.12	1.00 ± 0.16	1.02 ± 0.17	1.12 ± 0.12	1.15 ± 0.15
模型组	0.22 ± 0.03^a	0.31 ± 0.05^a	4.92 ± 0.81^a	0.34 ± 0.06^a	4.17 ± 0.81^a
维生素D组	0.81 ± 0.09^b	0.77 ± 0.15^b	1.64 ± 0.24^b	0.86 ± 0.10^b	1.59 ± 0.24^b
四妙汤低剂量组	0.32 ± 0.04	0.41 ± 0.07	4.11 ± 0.59^b	0.44 ± 0.09	3.53 ± 0.75
四妙汤中剂量组	0.53 ± 0.11^b	0.69 ± 0.07^b	2.84 ± 0.39^b	0.59 ± 0.11^b	2.22 ± 0.59^b
四妙汤高剂量组	0.78 ± 0.11^b	0.88 ± 0.10^b	1.79 ± 0.17^b	0.81 ± 0.09^b	1.83 ± 0.38^b
P值	<0.05	<0.05	<0.05	<0.05	<0.05

注：a表示与空白组相比P < 0.05，b表示与模型组相比P < 0.05，n = 3。

5. 讨论

近年来，RA患病人数日益增多，将可能持续成为影响我国居民健康的常见病，给患者及家庭带来严重的疾病负担[4]。现代研究发现，IL-17、IL-10、TGF-β、VDR、CYP27B1、CYP24A1、Foxp3、RORγt均与RA的发生发展具有密切相关性。IL-17作为RA炎症分子之一，是由Th17细胞分泌的促炎因子，参与RA发病过程，介导炎症细胞浸润关节，加重关节软骨的破坏，与关节损伤程度呈正相关[5]。IL-10是一种抗炎细胞因子，通过调节巨噬细胞代谢介导炎症反应，IL-10表达的升高有利于缓解关节炎小鼠的炎症症状，抑制疾病的发展[6]；RA患者接受抗风湿药物治疗后，IL-10基因表达水平显著升高[7]。TGF-β是T、B淋巴细胞分泌的通过调节血管内皮生长、炎症细胞的生长与分化的多肽因子，在人体免疫系统具有重要作用，TGF-β表达降低时，自身免疫性T细胞产生特异性应答，导致自身免疫性疾病的发生[8]。TGF-β能够促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞形成，缓解RA骨侵蚀，减轻骨损伤[9]。RA作为一种自身免疫性疾病，维生素D通过免疫调节参与RA发病过程，发挥抗炎作用，维生素D与RA疾病活动密切相关，RA患者普遍存在维生素D缺乏的情况，体内维生素D浓度越低，RA患病风险越高。VDR作为维生素D受体，是维生素D信号系统的重要参与者，也是调节活性维生素D基因表达的关键介质[10]。CYP27B1、CYP24A1是维生素D信号通路基因，研究发现，CYP27B1与维生素D水平降低有关，RA患者CYP27B1表达水平明显低于健康人群[11]，CYP24A1是参与25-羟基维生素D (25(OH)D₃)，分解代谢的羟化酶，调节维生素D₃在体内的生物利用度，CYP24A1水平升高会导致维生素D₃过度降解，使活性维生素D (1,25(OH)₂D₃)失活，抗炎作用减弱[12]。辅助性T细胞(Th17)和调节性T细胞(Treg)通过分泌多种细胞因子在免疫反应中发挥效应，其中Th17细胞在维甲酸相关孤儿核受体γt (RORγt)介导下完成诱导分化，介导各种自身免疫疾病，通过调节Th17细胞相关因子的表达，可有效缓解炎症反应的发展；Treg细胞在叉头/翼状螺旋转录因子3 (Foxp3)的特异性调控下完成分化过程，具有独特的免疫抑制作用，RA常规药物治疗药物DMARDs通过增加Foxp3基因表达，有效减少RA患者的疾病活动度和炎症发应[13]。

四妙汤为明末清初著名医家蒋示吉所创，收载于《医宗说约》，由黄芪、金银花、当归、甘草构成，具有益气和血、清热解毒之功。现代研究表明，四妙汤中君药黄芪有效成分黄芪总黄酮能抑制RA-FLS细胞增殖、诱导细胞凋亡，减轻关节软骨的损害，从而控制RA病情发展[14]；临床以西药联合四妙汤治疗关节炎能抑制炎症因子，有效改善病理症状，取得较为明显的治疗效果[15]。本研究通过CIA建立RA大鼠模型，从维生素D和Th17及Treg探讨四妙汤对RA大鼠的影响，结果显示四妙汤和维生素D能有效减轻RA大鼠关节损伤，减少炎性细胞浸润，改善大鼠关节病理症状。其进一步的分子机制研究结果显示，四妙汤和维生素D能够降低RA大鼠血清IL-17水平，升高IL-10、TGF-β水平，提示四妙汤和维生素D可抑制炎症反应，抑制疾病发展，其治疗靶点可能与四妙汤升高VDR、CYP27B1、Foxp3 mRNA表达、降低CYP24A1、RORγt mRNA表达水平密切相关。综上所述，四妙汤可通过调节关节滑膜组织中VDR、CYP27B1、CYP24A1、Foxp3、RORγt mRNA表达，改善大鼠血清IL-17、IL-10、TGF-β表达水平，发挥其干预RA的作用。

基金项目

教育厅滚动支持省属高校科研平台团队项目(黔科合基础-ZK[2022]一般001)；民族医药科学技术研究课题项目(QZYY-2021-025)。

NOTES

^*通讯作者。