人参皂苷Rg1通过MAPK通路对小鼠再生障碍性贫血治疗的影响

Effect of Ginsenoside Rg1 in Treating Aplastic Anemia in Mice via MAPK Pathway

摘要: 目的：本研究旨在评价人参皂苷Rg1对AA的保护作用，并进一步探讨其机制。方法：本研究通过注射环磷酰胺(CTX)建立骨髓抑制小鼠模型。CTX + Rg1组小鼠Rg1灌胃13 d。HE检测骨髓、胸腺和脾脏的病理变化。取小鼠眼眶血进行血常规检查。然后用流式细胞仪检测骨髓细胞的比例。通过WB检测MAPK通路中p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK、ERK的表达。结果：病理检查显示，CTX严重破坏小鼠骨髓、胸腺和脾脏的结构特征，降低骨髓造血细胞的比例。Rg1可通过抑制MAPK信号通路显著减轻小鼠骨髓抑制。结论：本研究提示人参皂苷Rg1通过MAPK信号通路缓解骨髓抑制作用，对AA有一定的治疗作用。

Abstract: Objective: This study was designed to evaluate the protective effects of ginsenoside Rg1 on AA and further investigate the underlying mechanism. Methods: In this study, Cyclophosphamide (CTX) was injected to establish the myelosuppression mouse model. The mice in the CTX + Rg1 group were treated with Rg1 for 13 days. The pathological changes of bone marrow, thymus, and spleen were detected through HE (Hematoxylin-Eosin St). Orbital blood of mice was collected for blood routine examination. Afterwards, the proportions of bone marrow cells were evaluated by flow cytometry assay. MAPK pathway was detected via WB for the expressions of p-p38, p38, p-JNK, JNK, p-ERK, and ERK. Results: Pathological examination revealed that CTX severely damaged the structural features of the bone marrow, thymus, and spleens, and decreased the proportion of hematopoietic cells in the bone marrow of mice. Treatment of Rg1 significantly alleviated myelosuppression in mice by inhibiting MAPK signaling pathway. Conclusion: This study suggested that ginsenoside Rg1 treated AA by alleviating myelosuppression through MAPK signaling pathway.

1. 前言

再生障碍性贫血(AA)是一种由物理、化学和生物因素所导致的原发性或继发性骨髓造血干细胞(HSCs)和/或造血微环境异常性疾病[1]。AA各年龄组均有发生，主要表现为全血细胞减少，可导致严重感染、贫血和出血[2]。AA是一种由T淋巴细胞异常激活和功能亢进所致的骨髓损伤，其中调节性T细胞(Treg)/辅助性T型17 (TH17)细胞的免疫失衡是AA的主要原因[3] [4]。随着免疫抑制治疗和造血干细胞移植的发展，再生障碍性贫血的预后有了明显的改善。然而，免疫抑制剂在某些患者中仍然无效[5] [6]。

人参(Panax ginseng C. A. Meyer)是五加科多年生草本植物，是传统中药材。具有振奋元气、补益津液、固发、健脾益肺、安神的作用[7]。人参皂苷是人参中的主要活性成分。根据皂苷元的结构，人参皂苷分为达玛烷型四环三萜皂苷、奥克梯隆型四环三萜皂苷和齐墩果酸皂苷[8]。近年来研究发现，人参皂苷的药理作用主要包括心肌保护、体内糖脂代谢、抗氧化、抗肿瘤和治疗血液系统疾病等[9]-[12]。人参皂苷能促进红系、粒系和巨核细胞系的增殖和分化，这可能与人参皂苷对造血生长因子(HGF)的影响有关[13]。骨髓基质中的细胞因子作为造血微环境的重要调节因子，可以作用于造血的各个阶段，包括促进造血祖/干细胞的增殖分化，延长造血细胞的存活。体外研究表明人参总皂苷(TSPG)可诱导促红细胞生成素(EPO)、粒细胞–巨噬细胞集落刺激因子(CSF)、白细胞介素3 (IL-3)、白细胞介素6 (IL-6)及促红细胞生成素受体和粒细胞–巨噬细胞集落刺激因子受体α链的显著升高[14]。人参皂苷还可刺激造血祖细胞GATA-2基因的mRNA表达和蛋白质合成的增加，GATA-2与DNA结合的增加可调控增殖相关基因的表达，从而促进血细胞增殖[15]。

MAPK信号通路主要包括c-jun氨基末端激酶(JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)和大丝裂原活化蛋白激酶(ERK5/BMK1) [16]，参与细胞生长、发育、分裂和死亡过程，以及细胞间多种生化反应信号的识别、传递和放大[17] [18]。研究发现人参皂苷Rg1通过MAPK途径抑制炎症因子IL-1β和IL-6的表达，减轻缺血再灌注的神经损伤[19]。张等人发现人参皂苷Rg1可通过MAPK途径促进小鼠骨髓内皮祖细胞增殖[20]。

本研究用环磷酰胺(CTX)建立小鼠骨髓抑制模型，HE染色观察骨髓病理变化，证明该模型是成功的。取小鼠眼眶血用于检查血液中细胞的组成。通过检测小鼠骨髓MAPK信号通路的细胞成分和蛋白表达变化，验证人参皂苷Rg1是否能通过MAPK信号通路减轻小鼠骨髓抑制，为临床治疗AA提供新的理论依据。

2. 方法

2.1. 动物

选用SPF级雄性BALB/c小鼠(6~8周龄) 25只，自由饮水和进食。室温保持在20℃~24℃，相对湿度为40%~60%。小鼠购自武汉赛维尔生物科技有限公司。

2.2. 药物

对于CTX (西格玛，圣路易斯，密苏里州，美国)，将200 mg粉末溶解在20 ml 0.9%的盐水中。人参皂苷Rg1 (中国辽宁大连宏九生物科技有限公司)的化学结构如图1(A)所示。

2.3. 模型准备

将小鼠随机分为5组：对照组、对照组 + RG1 (15 mg/kg)组、CTX + 生理盐水组、CTX + RG1 (10 mg/kg)组和CTX + RG1 (15 mg/kg)组，每组5只。动物模型制备流程如图1(B)所示。

2.4. 血液检查

取眼眶血后处死小鼠。采用血常规检测仪(RJ-0C107223，迈瑞，中国)进行全血血常规检查。

2.5. HE染色

HE染色按HE染色试剂盒(Solarbio，北京，中国)的规程进行。简言之，切片(4 μm)用苏木精–伊红染色1 min，并在酸性液体酒精中分化30 s。染色结束后，切片用95%的乙醇脱水50 s。最后，切片在二甲苯中清洗并固定。用日本尼康公司的CI-L显微镜获取图像，并用Image J软件进行分析。

2.6. 流式细胞术

收集骨髓细胞用于流式细胞分析。将骨髓细胞以每孔105个细胞的密度接种于加10% FBS (胎牛血清)的2毫升培养基中。培养不同时间间隔后，收集细胞，用PBS (磷酸盐缓冲液)洗涤2次，用0.25%胰蛋白酶进行胰蛋白酶化。然后，将收集的细胞在1500转/分下离心5分钟。在5毫升PBS中再悬浮后，用流式细胞术(Attune细胞分析仪，BD生物科学)对细胞进行分析。

2.7. 蛋白质印记

从骨髓中提取总蛋白进行Western印迹检测。蛋白样品与p38 (Abcam, Waltham, MA, USA)、p-p38 (Abcam, Waltham, MA, USA)、JNK (Abcam, Waltham, MA, USA)、p-JNK (Abcam, Waltham, MA, USA)、ERK (Abcam, Waltham, MA, USA)、p-ERK (Abcam, Waltham, MA, USA)共孵育。GADPH (Abcam，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)作为内部参考。

2.8. 统计分析

采用SPSS 24.0统计软件对实验数据进行统计分析，计量资料用均数 ± 标准差(X ± SD)表示，满足正态分布和方差齐性时，采用t检验(两组比较)或LSD方差分析(多组间比较)。采用Dunnett’s-t3法进行方差不均匀比较，P < 0.05为差异有统计学意义。

3. 结果

3.1. 人参皂苷Rg1对CTX诱导的骨髓抑制小鼠的作用

实验开始前，各组小鼠体重无明显差异。药物干预7 d后，CTX组小鼠体重低于对照组。 药物治疗13 d后，CTX组小鼠体重明显低于对照组；而CTX + Rg1 (15 mg/kg)组与对照组相比，体重无显著差异(图1(C))。与对照组相比，注射CTX后小鼠骨髓细胞数、胸腺和脾脏指数均明显下降。与CTX组相比，CTX + Rg1 (15 mg/kg)组小鼠骨髓细胞数、胸腺指数和脾脏指数均显著增加(图1(D)~(I))。提示Rg1可改善CTX诱导的小鼠骨髓抑制。

(A) 人参皂苷Rg1化学结构，(B) 实验流程图，(C) 小鼠体重图，(D) 骨髓标本HE染色，(E) 骨髓细胞统计图，(F) 胸腺HE染色，(G) 胸腺指数统计图，(H) 脾脏HE染色，(I) 脾脏指数统计图。所有统计图：n = 5只小鼠；^#与对照组比较，P < 0.05；^*与CTX组比较，P < 0.05。

Figure 1. Ginsenoside Rg1 prevents myelosuppression

图1. 人参皂苷Rg1可预防骨髓抑制

3.2. 人参皂苷Rg1对小鼠血细胞的影响

药物治疗后，小鼠眶后采血提取全血，测定全血计数和生化指标。如图2所示，CTX组小鼠白细胞(WBC)、中性粒细胞、淋巴细胞(RBC)、红细胞(RBC)、血红蛋白(HGB)和血小板(PLT)计数较对照组明显下降。与CTX组相比，CTX + Rg1 (15 mg/kg)组小鼠WBC、中性粒细胞、淋巴细胞、RBC、HGB计数明显增加，但PLT计数无明显增加(图2(A)~(F))。

白细胞数(A)，中性粒细胞(B)，淋巴细胞数(C)，红细胞数(D)，血红蛋白数(E)，血小板数(F)。WBC：白细胞；RBC：红细胞；HGB：血红蛋白；PLT：血小板；^#与对照组比较，P < 0.05；^###与对照组比较，P < 0.001；^**与CTX组比较，P < 0.01；^***与CTX组比较，P < 0.001。

Figure 2. Rg1 increased cell numbers in the peripheral blood of mice with myelosuppression

图2. Rg1增加骨髓抑制小鼠外周血中的细胞数量

3.3. 人参皂苷Rg1对再生障碍性贫血小鼠HSCs自我更新的影响

(A) 具有代表性的流式细胞术结果。(B) 流式细胞术统计图。^#P < 0.05，与对照组相比；^*与CTX组比较，P < 0.05。

Figure 3. Rg1 inhibits apoptosis of HSCs

图3. Rg1抑制造血干细胞凋亡

(A)~(E) 具有代表性的流式细胞术结果；(F) 流式细胞术统计图。

Figure 4. Rg1 increased the rate of the cell cycle of LSK

图4. Rg1使LSK细胞周期加快

流式细胞术显示CTX较对照组明显增加HSCs凋亡。而Rg1 (15 mg/kg)则明显降低HSCs的凋亡(图3(A)，图3(B))。如图4所示，CTX显著增加G0/G1期细胞数量，降低S期和G2/M期细胞数量，说明CTX显著抑制细胞生长。而Rg1 (15 mg/kg)处理可显著逆转上述变化。

3.4. 人参皂苷Rg1对MAPK通路的影响

(A) western blot图像。(B)~(D) 定量western blot图像。^##与对照组相比，P < 0.05；^*与CTX组比较，P < 0.05。

Figure 5. Rg1 alleviated myelosuppression in mice by inhibiting MAPK signaling pathway

图5. Rg1通过抑制MAPK信号通路减轻小鼠骨髓抑制

Western blot蛋白质印迹法分别测定p-p38，p38，p-JNK，JNK，p-ERK和ERK蛋白水平。与对照组相比，p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK蛋白表达明显增加。与CTX组相比，Rg1 (15 mg/kg)可降低p-P38/p38、p-JNK/JNK和p-ERK/ERK的表达水平(图5(A)~(D))。因此，我们认为Rg1通过激活MAPK信号通路减轻CTX诱导的骨髓抑制。

4. 讨论

再生障碍性贫血(AA)是儿童期常见的难治性血液疾病之一。AA患者因机体骨髓造血干细胞和(或)骨髓造血微环境功能障碍导致贫血；造血红髓被脂肪取代，导致血细胞计数降低[21]。在中医学中，AA被认为是“急性消耗病”和“骨髓缺乏症”[22]。越来越多的研究揭示了传统中草药治疗AA的有效性[23]-[25]。

多年来，人参皂苷Rg1一直用于治疗AA和骨髓损害。通过SIRT6/NF-κB信号转导轴抑制造血缺损，延缓造血干/祖细胞衰老[26] [27]；通过调节SIRT1-FOXO3和SIRT3-SOD2信号转导途径，维持HSC并调节HSC在骨髓中的增殖，防止HSC衰老，恢复造血[28] [29]。本研究通过注射CTX成功地建立了小鼠骨髓抑制模型。CTX是一种常用的化疗药物，抑制骨髓造血诱导AA [30]。我们观察到注射CTX后7天和13天小鼠体重下降。此外，CTX还能降低小鼠骨髓细胞数、胸腺和脾脏指数。血常规结果显示CTX组小鼠WBC、淋巴细胞、RBC、HGB、血小板PLT均明显降低。Rg1尤其是15 mg/kg注射液的Rg1能明显减轻CTX所致的小鼠骨髓抑制。因此，这些结果提示Rg1对AA有一定的改善作用。

造血是一个产生各种类型成熟血细胞的动态过程[31] [32]。骨髓是人出生后最重要的造血器官。在小鼠中，初级血液系统在血岛中产生血细胞，并从胚胎第7.5天开始在卵黄囊中产生一批原始红系细胞，主要包括红细胞、巨噬细胞(MFS)和巨核细胞(MKS) [33]。最终，在胚胎第10.5天左右，造血部位迁移到主动脉–性腺–中肾(AGM)区域，这是永久造血[34]。与成人骨骼研究一样，小鼠胎儿肝脏血液系统也由多个谱系组成[35]。淋巴细胞主要包括T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤(NK)细胞，而红细胞、粒细胞、巨核细胞和单核巨噬细胞属于髓系细胞[36] [37]。不成熟的祖细胞，包括粒细胞–巨噬细胞祖细胞(GMP)、普通髓系祖细胞(CMP)、巨核细胞红系祖细胞(MEP)和普通淋巴样祖细胞(CLP)，并不完全依赖于特定的谱系，可以通过适当的刺激重新定向[38]-[40]。

造血干细胞(HSCs)在造血中起着重要的作用。HSCs的稳态决定了各种造血/血细胞的命运。在小鼠中，HSC由Lin-Sca-1 + c-Kit + (LSK)免疫表型广义定义，并分为两种类型：长期HSC (LT-HSC)和短期HSC (ST-HSC) [41]。原始HSCs产生定向祖细胞，进一步分化为成熟血细胞[42]。本研究通过流式细胞术观察到CTX对小鼠骨髓细胞有明显的影响，使CMP、GMP、MEP和CLP减少。此外，CTX还增加了HSCs的凋亡，这与前人的研究一致。Rg1通过逆转CTX诱导的骨髓细胞损伤而改善小鼠造血功能障碍。

当GTP与RAS结合时，RAS被激活，将胞浆中的RAF募集到细胞膜上，最终激活MAPK。MAPK被激活后，可转导入细胞核，激活转录因子。研究表明，G-CSF结合GCSFR可通过Ras/MEK/ERK信号通路促进中性粒细胞生成和骨髓前体细胞向粒细胞分化[43] [44]。动物实验结果表明，MEK激酶抑制剂UO126能抑制G-CSF介导的骨髓细胞增殖[45]。相反，激活MAPK可增强G-CSF刺激状态阴性的骨髓细胞的增殖。p38 MAPK是MAPK的亚类之一，可直接参与细胞凋亡、细胞因子产生、细胞骨架识别和转录调控[46]。既往研究表明，细胞骨架蛋白可直接参与p38通路的调控，在细胞分化、迁移、增殖和凋亡中发挥重要作用，增加酪氨酸酶基因的表达水平，在骨髓抑制中发挥重要作用[47] [48]。CTX组p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK表达明显增高。同时，Rg1显著逆转了这些蛋白的表达。

5. 结论

人参皂苷Rg1通过抑制MAPK信号通路改善小鼠骨髓抑制，为临床治疗AA提供了理论依据。

基金项目

新疆维吾尔自治区自然科学基金2020D01A129。

伦理说明

本项目已通过济宁医学院临床医学院伦理委员会审核(JNRM-2021025)。

NOTES

^*通讯作者。