癌–睾丸抗原CT23在女性恶性肿瘤(乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌)诊断价值的探究

An Investigation of the Diagnostic Value of Cancer-Testis Antigen CT23 in Female Malignant Tumors (Breast, Ovarian, Endometrial)

摘要: 目的：探讨CT23及其抗体在女性恶性肿瘤(乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌)辅助诊断中的应用价值。方法：选取卵巢癌患者65例、乳腺癌患者54例、子宫内膜癌患者35例、盆腔良性肿瘤患者21例及健康对照组70例，通过ELISA检测血清中CT23含量及CT23抗体表达水平。结果：肿瘤组患者的CT23和CT23抗体平均含量均高于健康对照组，其中卵巢癌患者组与健康对照组差异具有统计学意义(P < 0.001)。ROC曲线分析显示，CT23对女性肿瘤的诊断价值有限，而CT23抗体可能是乳腺癌或卵巢癌的中度血清标志物。结论：CT23抗体在乳腺癌和卵巢癌的诊断中具有一定的参考价值，但其临床意义仍需进一步研究验证。

Abstract: Purpose: To explore the application value of CT23 and its antibody in the auxiliary diagnosis of female malignant tumors (breast, ovarian, endometrial). Methods: A total of 65 patients with ovarian cancer, 54 patients with breast cancer, 35 patients with endometrial cancer, 21 patients with benign pelvic tumors, and 70 healthy controls were selected. The levels of CT23 and CT23 antibody in serum were detected using ELISA. Results: The average levels of CT23 and CT23 antibody in the tumor group were higher than those in the healthy control group, with statistically significant differences in the ovarian cancer patient group (P < 0.001). ROC curve analysis showed that CT23 had limited diagnostic value for female tumors, while CT23 antibody might be a moderate serum marker for breast cancer or ovarian cancer. Conclusion: CT23 antibody has certain reference value in the diagnosis of breast cancer and ovarian cancer, but its clinical significance requires further research and verification.

1. 引言

二十一世纪的今天，肿瘤仍然是严重威胁人类生命和健康的主要疾病之一[1]。恶性肿瘤的早期诊断和有效治疗方案的制定对改善患者的预后具有重要意义。随着医学技术的发展，肿瘤免疫诊断和治疗的方法在临床中得到了越来越广泛的应用。开展肿瘤免疫诊疗的关键前提是找到一种理想的肿瘤标记物。目前，在临床肿瘤免疫诊疗中，肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen, TAA)仍然是应用最为广泛的标记物之一。

癌–睾丸抗原(Cancer-testis Antigen, CTA)是一类TAA，主要在男性生殖细胞和多种肿瘤组织中表达，而在成人的其他正常组织中几乎不表达[2]。目前，CTA公共数据库(http://www.cta.lncc.br)已收录了200多个CTA基因家族，根据CTA基因在染色体的位置，分为两大类：① CTX，编码基因定位于X染色体上，包括MAGE、GAGE和NY-ESO-1等；② Non-CTX，编码基因定位于非X染色体上，如CT23、SCP-1和AKAP3/4等，大量研究表明，许多CTA与肿瘤细胞的活力、增殖、转移和侵袭等生物学行为密切相关[2] [3]。目前，CTA已在肿瘤的诊断、治疗、病情监控和预后判断等方面得到了广泛应用[4]-[6]。

顶体结合蛋白(acrosin binding protein, ACRBP)，又称为OY-TES-1，由Ono等[7]于2001年首次鉴定并命名，因在CTA家族中排序第23位，故也称CT23。ACRBP蛋白的氨基端含有疏水区域及信号肽，经翻译后修饰形成成熟体蛋白，即精子蛋白32 (sperm protein 32, sp32)。sp32 (分子量为32KD)位于精子头部的顶体基质中，是一种结合蛋白，主要功能包括参与顶体酶原的包装和浓缩、促进顶体酶原活化、介导精子与透明带结合等。在正常成人组织中ACRBP主要分布于睾丸、附睾和射精精子[8] [10]。前期研究表明，CT23在肝癌、乳腺癌、卵巢癌、胶质瘤等多种肿瘤组织中高表达，并且在多种肿瘤患者血清中可检测到相应抗体[7] [11]-[14]，这些研究结果表明，CT23具有免疫原性，能引起特异性免疫应答，因此CT23有望成为肿瘤免疫诊疗的靶抗原。

本研究旨在探讨CT23是否可作为肿瘤诊断，尤其是女性恶性肿瘤诊断的辅助指标。研究选取了三种危害性极大的女性恶性肿瘤作为研究对象：乳腺癌(中国女性癌症发病率最高的癌症) [1]、卵巢癌(中国女性生殖道恶性肿瘤死亡率居首位) [15] [16]以及子宫内膜癌(在中国女性生殖系统恶性肿瘤中居第二位) [1] [17]。研究通过比较健康人群、盆腔良性肿瘤患者、乳腺癌患者、卵巢癌患者和子宫内膜癌患者血清中CT23的含量及其抗体表达情况，进而探讨CT23在女性恶性肿瘤辅助诊断中的应用价值，为CT23在恶性肿瘤辅助诊疗中的应用提供理论依据。

2. 材料与方法

2.1. 样本和主要试剂

所有病例为广西医科大学附属医院2019~2021年住院患者，均未接受抗癌治疗，并经过组织病理学检查确诊。其中包括：卵巢癌患者65例、乳腺癌患者54例、子宫内膜癌患者35例，盆腔良性肿瘤患者21例。70例健康女性为25~45岁的志愿者。所有受试者空腹采集静脉2 ml，4500 r/min离心5分钟分离血清，−20℃保存备用。

Human ACRBP和Human ACRBP-Ab ELISA Kit均为酶联生物公司试剂盒。

2.2. ELISA

试剂盒在室温(20~25℃)放置30分钟。取出96孔板，设置空白孔、标准孔和样品孔。标准孔分别加入不同浓度的标准品各50 μl，样品孔加入稀释液40 μl和待测样品10 μl，各孔均设置2复孔。除空白孔外各孔加入酶标试剂100 μl/孔，封板后，37℃孵育60分钟。洗涤液洗涤5次，每次30秒。拍干后加入显色剂A、B各50 μl/孔，37℃孵育15分钟。加入终止液50 μl/孔，450nm波长测定各孔吸光度。根据标准孔的OD和浓度绘制标准曲线，计算血清样品中ACRBP/ACRBP-Ab的含量。

2.3. 结果观察指标

2.3.1. ACRBP/ACRBP-Ab诊断的临界值

分别绘制ACRBP、ACRBP-Ab诊断卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌患者工作特征曲线(receiver operating characteristic, ROC)，根据各切点的敏感度和特异度，计算约登指数 = Sensitivity% − (1 − Specificity%)，以约登指数最大所对应的数值作为最佳临界值(cut-off值)。

2.3.2. 诊断效果评价

采用敏感度、特异度和ROC下面积(area under curve, AUC)评价诊断效果。AUC < 0.5为无诊断价值，0.5~0.7为诊断准确性较低，0.7~0.9为诊断准确性较高，>0.9为诊断准确性最高。

2.4. 统计学方法

采用GraphPad Prism软件、SPSS17. 0软件分析数据。本研究中所有血清样品均进行双孔检测，所得样品A值均取复孔均值。计量资料用均数 ± 标准差(x ± SD)表示，2组间均值差异采用Mann-Whiney U test比较(数据非正态分布)，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

应用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic, ROC)获得曲线下面积(area under the curve, AUC)，评价诊断效能。

3. 结果

3.1. 肿瘤患者和健康体检者血清ACRBP的水平比较

研究结果显示，与健康对照组相比，各肿瘤患者组的血清ACRBP平均水平升高(见表1)。其中，卵巢癌患者的血清ACRBP含量与健康对照组相比差异具有统计学意义(P < 0.001) (见图1)。

Table 1. The average content of ACRBP and ACRBP-Ab in the serum of tumor patients or healthy physical examinees

表1. 肿瘤患者或健康体检者血清中ACRBP和ACRBP-Ab的平均含量

	健康体检者	盆腔良性肿瘤患者	卵巢癌患者	乳腺癌患者	子宫内膜癌患者
人数	70	21	65	54	35
ACRBP (ng/ml)	9.34 ± 5.15	13.76 ± 6.46	18.58 ± 17.28	11.66 ± 12.2	13.96 ± 12.62
ACRBP-Ab (ng/ml)	57.37 ± 32.42	61.8 ± 24.0	140.89 ± 135.68	32.53 ± 23.97	50.47 ± 43.25

Figure 1. The content of ACRBP in the sera of each group

图1. 各组血清中ACRBP的含量

3.2. 肿瘤患者和健康体检者血清ACRBP-Ab的水平比较

Figure 2. The content of ACRBP-Ab in the sera of each group

图2. 各组血清中ACRBP-Ab的含量

与健康对照组相比，各肿瘤患者组的ACRBP-Ab平均水平均呈现升高趋势(见表1)。其中，卵巢癌患者的血清ACRBP-Ab含量显著高于健康对照组(P < 0.0001) (见图2)。

3.3. 血清ACRBP和ACRBP-Ab在卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌检测的诊断价值

血清ACRBP的ROC曲线分析显示，与健康体检者相比，ACRBP对卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌诊断的AUC值均在0.5~0.7之间，提示其诊断准确性较低。与盆腔良性肿瘤患者相比，ACRBP对卵巢癌诊断的AUC值为0.5271，说明血清中ACRBP对检测卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌这些女性肿瘤诊断的效能有限。

A. 血清ACRBP和ACRBP-Ab区分卵巢癌和健康体检者的ROC曲线；B. 血清ACRBP和ACRBP-Ab区分卵巢癌和盆腔良性肿瘤的ROC曲线；C. 血清ACRBP和ACRBP-Ab区分子宫内膜癌和健康体检者的ROC曲线；D. 血清ACRBP和ACRBP-Ab区分乳腺癌和健康体检者的ROC曲线。

Figure 3. ROC curves for the discrimination of patients in each tumor group and healthy physical examination individuals by serum ACRBP and ACRBP-Ab

图3. 血清ACRBP和ACRBP-Ab区分各肿瘤组患者和健康体检者的ROC曲线

血清ACRBP-Ab的ROC曲线分析显示，与健康体检者比较，ACRBP-Ab对卵巢癌诊断的AUC值为0.7511 (95%置信区间：0.6683~0.8339，P < 0.001)。根据Cut-off值的判断标准，ACRBP-Ab对卵巢癌的诊断Cut-off值为0.4945，此时，检测ACRBP-Ab的敏感性和特异性分别为 52.31%和97.14%。而在此Cut-off值时，ACRBP-Ab区分卵巢癌和盆腔良性肿瘤的AUC值为0.7289 (95%置信区间：0.6250~0.8329，P < 0.05)，敏感度为49.23%，特异度为100% (图3(A)、图3(B))。与健康体检者相比，ACRBP-Ab对子宫内膜癌诊断的AUC值为0.5963 (图3(C))，小于0.7，用于子宫内膜癌诊断的准确性较低，而ACRBP-Ab对乳腺癌诊断的AUC值为0.7366 (95%置信区间：0.6471~0.8262，p < 0.001) (图3(D))。根据Cut-off值的判断标准，ACRBP-Ab对乳腺癌的诊断Cut-off值为0.499，此时，检测ACRBP-Ab的敏感性和特异性分别为87.04%和62.86%。

4. 讨论

乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌是三种危害性极大的女性恶性肿瘤，早诊早治能显著提高患者的生存质量。肿瘤标志物检测在这些疾病的筛查和辅助诊断中具有重要价值。卵巢癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤，其发病隐匿，早期症状不明显，许多患者确诊时已处于晚期，预后较差，死亡率较高[11]。目前用于卵巢癌诊断的血清肿瘤标志物主要有癌抗原125 (cancer antigen, CA125)、人附睾蛋白4 (human epididymis protein, HE4)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen, CEA)、共刺激分子B7同源体4 (B7 homologous body 4, B7-H4)、间皮素(MSLN)、溶血磷脂酸(LPA)、骨桥蛋白(OPN)等[18]-[20]。然而，这些肿瘤标志物的敏感性和特异性尚不理想，通常需要联合检测以提高诊断效能[21]-[24]。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，具有较高的恶性程度和死亡率[1]。传统的乳腺癌检查方法，如乳房X线检查、超声等在早期筛查中的效果有限，而血清学检测作为一种便捷的筛查手段，受到广泛关注。乳腺癌相关的肿瘤标志物包括：CA153、雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)、CEA等，但其灵敏度和特异度均偏低[25]。此外，p53、c-myc、Her2、Muc1和survivin等的自身抗体虽与乳腺癌早期检测相关，但目前尚未达到临床应用所需的敏感性和特异性[26] [27]，因此没能进一步在临床上应用。子宫内膜癌多为局部病变，早期症状如不规则阴道流血和阴道排液子宫内膜癌辅助诊断的血清肿瘤标志物包括CA153、CA199、CA724、HE4、人软骨糖蛋白39 (YKL-40)、血管内皮生长因子(VEGF)和CEA等，其中CA125和HE4应用最为广泛[17]。子宫内膜癌多为局部病变，早期不规则阴道流血和阴道排液等症状常被忽视，导致诊断延迟，确诊时多为中晚期。目前用于子宫内膜癌辅助诊断的肿瘤标志物主要包括CA153、CA199、CA724、HE4、人类软骨糖蛋白39、血管内皮生长因子、癌胚抗原，CEA等，其中CA125和HE4应用最为广泛。 然而，CA125的诊断敏感性有限，且在子宫内膜异位症等疾病中也可能升高；HE4对子宫内膜癌的诊断价值仅为中等水平[17]。因此，目前仍以联合检测为主，缺乏高敏感性和特异性的血清肿瘤标志物。尽管临床已发现数十种可用于乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌的血清肿瘤标志物，但许多肿瘤标志物的敏感性和特异性仍不理想。开发更具代表性、更高敏感性和特异性的肿瘤血清标志物仍是临床研究的重要方向。

CT23不仅在男性生殖细胞中表达，还在多种肿瘤中表达，而且过表达的CT23与肿瘤的预后及肿瘤细胞的一些恶性行为密切相关，如CT23可通过抑制NuMA (Nuclear Mitotic Apparatus Protein)使有丝分裂纺锤体功能正常化而促进癌细胞增殖[28]，下调CT23的表达可降低癌细胞生长，阻止癌细胞的迁移和侵袭，并上调凋亡相关蛋白的表达，从而促进细胞凋亡[29] [30]。在卵巢癌患者中，CT23高表达与紫杉醇耐药、分期及化疗敏感性、生存时间缩短和复发速度加快等相关[11] [28]，而在结直肠癌患者中也证实CT23高表达与肿瘤浸润分期、组织学分级相关[13]。此外在多种肿瘤患者血清中可检测到CT23抗体，而正常人血清中CT23抗体则为阴性，说明CT23具有免疫原性，能引起特异性免疫应答[7] [11]-[14]。总而言之，CT23具有以下特点：仅在睾丸等免疫豁免部位限制性表达而在多种恶性肿瘤组织高表达、和肿瘤细胞的多种恶性行为密切相关、具有免疫原性，这提示CT23或CT23抗体有望成为肿瘤免疫诊断的血清标志物。

为了进一步证实CT23或CT23抗体在女性恶性肿瘤中诊断的意义，本研究采用ELISA方法检测了65例卵巢癌患者、21例盆腔良性肿瘤患者、54例乳腺癌患者、35例子宫内膜癌患者和70例健康体检者血清中CT23和CT23抗体的含量，并进行了ROC曲线分析以评估其诊断效能。结果显示，CT23用于女性肿瘤诊断价值有限，而CT23抗体在卵巢癌、乳腺癌的诊断中有较好的价值，尤其在卵巢癌的诊断中特异性较好。CT23在女性恶性肿瘤患者血清中增高水平并不是很明显，甚至有部分患者血清中有高水平CT23抗体但CT23并不升高，这和之前课题组报道的一致，因而血清中CT23用于女性肿瘤诊断的临床意义有限。CT23抗体对卵巢癌和乳腺癌的诊断具有一定价值，但对子宫内膜癌的诊断价值有限，说明CT23抗体含量在不同女性恶性肿瘤表达有差别，这可能和肿瘤的组织学来源以及分期有关，但考虑到研究样本量较少，尤其子宫内膜癌仅有35例，患者对CT23产生免疫应答能力存在差异，今后仍需进行大样本、高质量的病例对照研究，以进一步证实CT23抗体在女性恶性肿瘤在早期诊断的应用价值。

5. 小结

本研究通过ELISA法分别检测了65例卵巢癌患者、54例乳腺癌患者、35例子宫内膜癌患者、21例盆腔良性肿瘤患者和70例健康体检者血清中CT23和CT23抗体的含量，并进行了ROC曲线分析以评估VCT23和CT23抗体对女性恶性肿瘤的诊断效能。结果显示ACRBP-Ab对卵巢癌和乳腺癌诊断的AUC值大于0.7，提示CT23抗体可能是乳腺癌或卵巢癌的中度血清标志物。尤其在卵巢癌的诊断中特异性较好，但其临床意义仍需进一步研究验证。

资助项目

广西医科大学“大学生创新创业”项目(编号202310598007)。

NOTES

^*共同第一作者。

^#共同通讯作者。