加巴喷丁通过δGABA_A受体缓解神经病理性疼痛抑郁行为

Gabapentin Alleviates Neuropathic Pain and Depressive Behavior through δGABA_A Receptors

摘要: 目的：探讨加巴喷丁对神经病理性疼痛抑郁行为的影响和机制。方法：将36只SPF级雄性C57/B6小鼠8周龄采用随机数字表法均分为3组(n = 12)：假手术组(Sham组)、神经病理性疼痛组(CCI组)和加巴喷丁组(Gap组)。采用坐骨神经慢性缩窄法(Chronic Constriction Injury, CCI)建立神经病理性疼痛模型，术后第30天Gap组腹腔注射加巴喷丁100 mg/kg，Sham和CCI组给予等容量生理盐水，连续7天。术前和术后第7、14、21、28和40 d测定各组大鼠机械缩足反应阈值(PMWT)和热缩足潜伏期(PTWL)，评价小鼠疼痛行为；术前和术后第28、40天，采用悬尾实验(TST)和高架十字迷宫实验(EPM)，评价小鼠抑郁行为。通过蛋白质免疫印迹检测小鼠海马δGABA_A受体蛋白表达。结果：与Sham组相比，CCI组术后第7、14、21、28和40 d的PMWT显著下降、PTWL显著缩短(P < 0.05)；术后第28 d和40 d，悬尾实验(TST)的不动时间显著延长(P < 0.05)；高架十字迷宫测试(EPM)探索开放臂的时间显著减少(P < 0.05)；海马δGABA_A受体蛋白表达显著下降(P < 0.05)；Gap组术后第28 d PMWT显著下降、PTWL显著缩短(P < 0.05)；悬尾实验(TST)的不动时间显著延长(P < 0.05)；高架十字迷宫测试(EPM)探索开放臂的时间显著减少(P < 0.05)。与CCI组相比，Gap组术后第40 d PMWT显著增加，PTWL显著延长(P < 0.05)；悬尾实验(TST)的不动时间显著减少(P < 0.05)；高架十字迷宫测试(EPM)探索开放臂的时间显著增加(P < 0.05)；海马δGABA_A受体蛋白表达显著增加(P < 0.05)。结论：加巴喷丁缓解神经病理性疼痛行为的同时，可以改善神经病理性疼痛相关抑郁行为，可能与加巴喷丁增加海马δGABA_A受体的表达有关。

Abstract: Objective: Discuss the effects and mechanisms of gabapentin on neuropathic pain and depressive behavior. Methods: 36 SPF grade male C57/B6 mice, 8 weeks old, were randomly divided into 3 groups (n = 12) using a random number table: sham group (Sham group), neuropathic pain group (CCI group), and gabapentin group (Gap group). The neuropathic pain model was established using the chronic constriction injury (CCI) of the sciatic nerve. On the 30th day post-operation, the Gap group was injected intraperitoneally with gabapentin at 100 mg/kg, while the Sham and CCI groups were given an equal volume of normal saline for 7 consecutive days. Before surgery and on day post operative 7, 14, 21, 28, and 40, the mechanical withdrawal threshold (PMWT) and thermal withdrawal latency (PTWL) were measured in each group of rats to evaluate pain behavior; before surgery and on day post operative 28 and 40, the tail suspension test (TST) and elevated plus maze (EPM) were used to assess depressive behavior in mice. Detection of δGABA_A receptor protein expression in mouse hippocampus by Western blotting. Results: Compared with the Sham group, the CCI group showed a significant decrease in PMWT and a significant shortening of PTWL on postoperative days 7, 14, 21, 28, and 40 (P < 0.05); on postoperative days 28 and 40, the immobility time in the tail suspension test (TST) was significantly prolonged (P < 0.05); the time spent exploring the open arms in the elevated plus maze test (EPM) was significantly reduced (P < 0.05); hippocampal δGABA_A receptor protein expression was significantly decreased (P < 0.05); the Gap group showed significantly decreased PMWT and significantly shortened PTWL on postoperative day 28 (P < 0.05); the immobility time in the tail suspension test (TST) was significantly prolonged (P < 0.05); the time spent exploring the open arms in the elevated plus maze test (EPM) was significantly reduced (P < 0.05). Compared with the CCI group, the Gap group exhibited significantly increased PMWT and significantly prolonged PTWL on postoperative day 40 (P < 0.05); the immobility time in the tail suspension test (TST) was significantly reduced (P < 0.05); the time spent exploring the open arms in the elevated plus maze test (EPM) was significantly increased (P < 0.05); hippocampal δGABA_A receptor protein expression was significantly increased (P < 0.05). Conclusion: Gabapentin can alleviate neuropathic pain behaviors while improving depression behaviors associated with neuropathic pain, which may be related to the increase in the expression of hippocampal δGABA_A receptors by gabapentin.

1. 引言

神经病理性疼痛(Neurpathic Pain, NP)是损伤或疾病累及包括外周和中枢水平在内的躯体感觉系统的结果。经调查显示普通人群神经病理性疼痛的患病率约为3.3%~8.2% [1]。神经病理性疼痛表现为痛觉过敏、痛觉异常和自发痛，同时伴有情感变化，表现抑郁、焦虑、睡眠障碍和认知障碍等。疼痛和抑郁行为存在神经元过度兴奋，可能与大脑γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric Acid, GABA)介导的抑制性突触传递受损有关[2]。

加巴喷丁是神经病理性疼痛的一线治疗药物，也可以缓解慢性神经性疼痛状态下的抑郁行为，其镇痛作用与抗抑郁作用可能涉及不同的介导机制[3] [4]。海马负责学习记忆和情感情绪调控，加巴喷丁促进海马齿状回神经元的神经发生，增加中枢神经系统含δ亚基GABA_A (δGABA_A)受体表达，但加巴喷丁对神经病理性疼痛抑郁行为的影响及其机制目前尚不清楚[5]。本研究拟通过建立小鼠动物模型，探讨加巴喷丁对神经病理性疼痛和疼痛相关抑郁行为的影响及机制。

2. 材料与方法

2.1. 材料

2.1.1. 实验动物及分组

本研究获得伦理委员会批准(审批号：LLSC20232257)。36只SPF级健康的雄性C57BL/6，8周龄，体质量18~25 g，购自杭州子源实验动物科技有限公司，室温22~24℃，相对湿度40%~50%，12 h的光照和12 h的黑暗周期(07:00~19:00之间给予光照)，适应性饲养一周。按随机数字表法分为3组(n = 12)：假手术组(Sham组)、神经病理性疼痛(CCI组)和加巴喷丁组(Gap组)。

2.1.2. 主要试剂

加巴喷丁(产品批号：E01-20230324)江苏恩华药业股份有限公司提供；鼠抗GABA_A Rδ抗体(H-4) (货号：sc-271231)。

2.2. 方法

2.2.1. NP小鼠模型的建立及药物干预

参考文献[6]采用坐骨神经慢性缩窄性损伤(Chronic Constriction Injury, CCI)制备NP模型。在对小鼠进行腹腔注射麻醉(使用10%水合氯醛，剂量为0.05 ml/10 g体重)后，剃除其左后肢的毛发，并用碘伏进行消毒。接着，在股骨外侧切开皮肤，通过钝性分离肌肉组织，以暴露坐骨神经。使用玻璃分针仔细地将神经与周围组织分离。随后，使用6-0羊肠线对坐骨神经进行三次结扎，每道结扎间隔大约1 mm。结扎的力度应以引起腿部肌肉轻微抽搐为标准。完成结扎后，依次缝合肌肉层和皮肤层。对照组的小鼠仅进行神经暴露操作，不执行结扎步骤。

药物干预：于模型建立后第28天，Gap组给予加巴喷丁(100 mg/kg)腹腔注射，Sham组和CCI组给予等量生理盐水腹腔注射，连续7天。

2.2.2. 机械痛阈测定

术前及术后7、14、21、28和40 d的相同时间点，测定小鼠的机械缩足反射阈值(PWMT) [7]。在安静的环境下，将小鼠放置于带有金属网格的筛网之上，并使用有机玻璃笼子将它们隔开。经过30分钟的适应期后，使用Von Frey触痛仪的刺激针以垂直方向对小鼠的左侧足底皮肤进行刺激，力度逐渐增强，同时观察小鼠的缩足反应。每只小鼠的每只足部将接受3次刺激，每次刺激间隔超过10秒。当小鼠在受到刺激后出现抬腿和缩足动作时，这被视为阳性反应。记录下电子Von Frey仪的读数，并将三次读数的平均值作为机械缩足阈值(PWMT，克)，以反映机械痛觉敏感性。

2.2.3. 热痛阈测定

术前及术后7、14、21、28和40 d的相同时间点测定热缩足反射潜伏期(PWTL) [8]。在安静的环境中，将小鼠单独放置于20 cm × 20 cm × 40 cm大小有机玻璃笼内，笼底为后0.22 mm玻璃，待小鼠适应环境30 min后，光辐射热照射足底表面，每足照射3次，间隔5~10 min，20 s内缩足视为阳性，纪录从照射到缩足的时间，3次时间的平均值记为热缩足反射潜伏期(PWTL, s)反映热痛敏。

2.2.4. 悬尾实验

术前及术后28和40 d的相同时间点进行悬尾实验(TST)的测定[9]。在安静的环境中，利用胶带将小鼠的尾巴(距离尾端2厘米处)固定，使每只小鼠悬空6分钟。记录测试的后5分钟的时间段，以秒为单位计算小鼠保持静止状态的总时长。

2.2.5. 高架十字迷宫实验

术前和术后28和40 d相同时间点测定高架十字迷宫实验(EPM) [10]。使用十字形装置进行试验，该装置具有两个开放臂和两个闭合臂，装置距地面60 cm的高度，并置于光线昏暗的房间中。小鼠自由探索迷宫6分钟，同时记录后5分钟进入开放和闭合臂的持续时间和频率。将进入开放臂的次数占总臂次数的百分比和开放臂的探索时间作为焦虑抑郁的衡量标准。

2.2.6. 蛋白免疫印迹试验

术后40 d，小鼠麻醉后断头，剥离出完整大脑，分离出小鼠海马组织，放入研磨管内，置于−80℃冰箱中保存。将海马组织加入RIPA裂解液，研磨后，12,000 r/min离心15 min，取上清液测定蛋白浓度。配制10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶，上样后电泳、转膜、快速封闭液封闭、TBST洗涤后分别加入兔抗GAPDH抗体(1:10,000)、鼠抗δGABA_A抗体(1:500) 4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次10 min。滴加相应的山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗(1:10,000)，摇床上反应1 h，TBST漂洗3次，每次10 min。随后在成像系统上显出蛋白条带。Image J图像分析软件测定条带灰度值，以目的蛋白条带与内参条带灰度值的比值来反映目的蛋白的相对表达水平。

2.3. 统计学处理

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料以均数 ± 标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

3. 结果

3.1. NP及加巴喷丁干预对小鼠机械痛和热敏痛的影响

Table 1. Comparison of PWMT among three groups of mice at different time points (g, n = 12, $\overline{x}\pm s$ )

表1. 三组小鼠不同时间点PWMT的比较(g, n = 12, $\overline{x}\pm s$ )

组别	术前	术后7 d	术后14 d	术后21 d	术后28 d	术后40 d
Sham	8.3 ± 0.7	7.4 ± 0.6	7.7 ± 0.5	7.9 ± 0.5	7.6 ± 0.5	8.0 ± 0.6
CCI	8.4 ± 0.7	5.6 ± 0.6^ab	5.5 ± 0.7^ab	5.5 ± 0.6^ab	5.6 ± 0.7^ab	5.7 ± 0.5^ab
Gap	8.3 ± 0.8	5.6 ± 0.7^ab	5.5 ± 0.6^ab	5.6 ± 0.7^ab	5.7 ± 0.6^ab	7.2 ± 0.4^c

注：与术前比较，^aP < 0.05与Sham组比较，^bP < 0.05与CCI组比较，^cP < 0.05。

Table 2. Comparison of PWTL among three groups of mice at different time points (s, n = 12, $\overline{x}\pm s$ )

表2. 三组小鼠不同时间点PWTL的比较(s, n = 12, $\overline{x}\pm s$ )

组别	术前	术后7 d	术后14 d	术后21 d	术后28 d	术后40 d
Sham	12.70 ± 1.0	12.46 ± 0.9	12.41 ± 0.9	12.67 ± 0.7	12.95 ± 0.6	12.78 ± 0.6
CCI	12.59 ± 0.9	7.97 ± 0.75^ab	7.66 ± 0.7^ab	7.78 ± 0.6^ab	7.72 ± 0.7^ab	7.76 ± 0.8^ab
Gap	12.90 ± 1.0	7.75 ± 0.7^ab	7.76 ± 0.7^ab	7.82 ± 0.5^ab	7.71 ± 0.6^ab	11.62 ± 0.8^c

注：与术前比较，^aP < 0.05与Sham组比较，^bP < 0.05与CCI组比较，^cP < 0.05。

各组小鼠术前机械痛和热敏痛无统计学差异(P > 0.05)，与Sham组小鼠相比，CCI组术后第7、14、21、28和40 d的PMWT显著下降、PTWL显著缩短(P < 0.05)；Gap组术后第28 d PMWT显著下降、PTWL显著缩短(P < 0.05)；与CCI组相比，Gap组术后第40 d PMWT显著增加，PTWL显著增加(P < 0.05)。说明加巴喷丁可以显著缓解神经病理性疼痛。见表1、表2。

3.2. NP及加巴喷丁干预对小鼠抑郁样行为的影响

各组小鼠术前TST和EPM术前无统计学差异(P < 0.05)。与Sham组相比，CCI组术后第28 d和40 d，悬尾实验(TST)的不动时间显著延长(P < 0.05)；高架十字迷宫测试(EPM)探索开放臂的时间显著减少(P < 0.05)；Gap组术后第28d悬尾实验(TST)的不动时间显著延长(P < 0.05)；高架十字迷宫测试(EPM)探索开放臂的时间显著减少(P < 0.05)。与CCI组相比，Gap组术后第40d悬尾实验(TST)的不动时间显著减少(P < 0.05)；高架十字迷宫测试(EPM)探索开放臂的时间显著增加(P < 0.05)。说明小鼠在28周出现了焦虑抑郁样行为，且抑郁样情绪在连续使用加巴喷丁7天后有所改善，见表3、表4。

Table 3. Comparison of TST immobility time among three groups of mice at different time points (s, n = 12, $\overline{x}\pm s$ )

表3. 三组小鼠不同时间点TST不动时间的比较(s, n = 12, $\overline{x}\pm s$ )

组别	术前	术后28d	术后40d
Sham	125 ± 3.9	127 ± 3.3	125 ± 3.2
CCI	125 ± 3.3	158 ± 5.6^ab	157 ± 5.7^ab
Gap	125 ± 4.1	157 ± 6.1^ab	132 ± 4.2^c

注：与术前比较，^aP < 0.05与Sham组比较，^bP < 0.05与CCI组比较，^cP < 0.05。

Table 4. Comparison of EPM open arm exploration time among three groups of mice at different time points (s, n = 12, $\overline{x}\pm s$ )

表4. 三组小鼠不同时间点EPM探索开放臂时间的比较(s, n = 12, $\overline{x}\pm s$ )

组别	术前	术后28d	术后40d
Sham	24.43 ± 1.6	18.60 ± 0.8	21.90 ± 1.8
CCI	24.91 ± 1.7	8.89 ± 1.2^ab	8.92 ± 1.1^ab
Gap	24.80 ± 2.1	8.85 ± 0.9^ab	19.66 ± 1.6^c

注：与术前比较，^aP < 0.05与Sham组比较，^bP < 0.05与CCI组比较，^cP < 0.05。

3.3. CCI及药物干预对小鼠海马δGABA_A受体表达的影响

与Sham组相比，CCI组海马δGABA_A受体蛋白表达明显下降(P < 0.05)，与CCI组相比，Gap组海马δGABA_A受体蛋白表达显著增加(P < 0.05)，见表5。

Table 5. Comparison of δGABA_A receptor expression in hippocampal tissues among three groups of mice(n = 3, $\overline{x}\pm s$ )

表5. 三组小鼠海马组织中δGABA_A受体表达的比较(n = 3, $\overline{x}\pm s$ )

组别	δGABAA受体
Sham	1.00
CCI	0.54 ± 0.07^a
Gap	0.99 ± 0.01^b

注：与Sham组比较，^aP < 0.05与CCI组比较，^bP < 0.05。

4. 讨论

神经病理性疼痛与伤害性疼痛存在显著差异，常规的止痛药物往往无法有效缓解NP，NP往往可能导致抑郁、焦虑、睡眠障碍以及认知功能受损[11]。加巴喷丁是神经病理性疼痛的一线治疗药物，我们发现加巴喷丁类药物缓解神经病理性疼痛的同时，也可以缓解神经病理性疼痛抑郁行为。

GABA是哺乳动物脊髓背角和大脑中的主要抑制性神经递质，在脊髓或大脑中的伤害性信息传递中起着重要的作用。GABA能神经传递在大脑功能中起着关键作用，它通过多种受体类型分布于中枢和周围神经系统，调节着皮质和皮质下回路的神经元兴奋性[12]。大脑中兴奋性与抑制性平衡的失调是许多精神疾病和神经疾病病理生理的基础。δGABA_A受体的一个显著特点是它们的表达水平高度动态，并且在发育过程中以及对包括压力和生殖周期在内的生理变化作出反应时会显著波动。在病理条件下，如酒精中毒、癫痫、抑郁症、精神分裂症、情绪障碍和创伤性脑损伤等，它们的表达水平也会有所不同[13]。本实验发现NP致抑郁会导致小鼠海马区域δGABA_A受体的表达降低，提示δGABA_A受体在抑郁中发挥着重要作用。

加巴喷丁在临床有效剂量下仅有轻微副作用，已广泛用于治疗慢性疼痛。加巴喷丁已经展现出治疗多种精神疾病的潜力包括抑郁症、焦虑症和创伤后应激障碍等。作为一种γ-氨基丁酸(GABA)的结构类似物，加巴喷丁并不直接作用于GABA受体，而主要通过增加神经胶质细胞非囊泡机制(例如通道介导的释放)释放GABA来增强GABA活性，也可通过激活GABA合成酶谷氨酸脱羧酶来增加了人类和啮齿类动物的GABA水平，此研究指出δGABA_A受体表达增加是解释加巴喷丁GABA功能特性的一种新机制[5]。本研究发现加巴喷丁可以明显改善小鼠的NP引起的痛觉过敏，并对NP导致的抑郁样行为有治疗效果。同时，本实验发现加巴喷丁可以逆转NP致小鼠海马区域δGABA_A受体的表达降低。

因此，海马区域δGABA_A受体可能是加巴喷丁改善NP所致抑郁的治疗靶点。

综上所述，加巴喷丁缓解NP所致的抑郁行为，其机制可能与增加海马δGABA_A受体表达有关。

基金项目

安徽省临床医学研究转化专项(202304295107020018)。

NOTES

^*通讯作者。