传染性单核细胞增多症患儿外周血淋巴细胞亚群分布——特征及与EB病毒载量的相关性分析

Distribution of Peripheral Blood Lymphocyte Subsets in Pediatric Patients with Infectious Mononucleosis—Characterization and Correlation Analysis with Epstein-Barr Viral Load

摘要: 目的：探讨传染性单核细胞增多症(IM)患儿外周血淋巴细胞亚群分布特征及与EB-DNA载量的相关性。方法：选取在安徽医科大学第二附属医院就诊的传染性单核细胞增多症患儿45例，依据EB-DNA载量分为低病毒载量组(<10⁵ copies/mL) 22例和高病毒载量组(≥10⁵ copies/mL) 23例。分析患儿外周血淋巴细胞亚群百分比的分布情况及与EB病毒DNA载量的相关性分析。采用受试者特征曲线(ROC)评估外周血淋巴细胞亚群对疾病转归的预测价值。结果：与低病毒载量组相比，高病毒载量组淋巴亚群CD3⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞频率明显上升(P < 0.01, P < 0.001)；CD4⁺ T细胞、CD19⁺B细胞和调节性T细胞(Treg)频率及CD4⁺/CD8⁺比值显著降低(P < 0.01, P < 0.05, P < 0.05, P < 0.01)；CD3-CD16⁺CD56⁺NK细胞频率则无显著性差异(P > 0.05)。Pearson相关性分析结果显示CD3⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞频率均与EB-DNA载量呈正相关(P < 0.001, P < 0.001)；CD4⁺ T细胞频率、CD19⁺ B细胞频率、Treg细胞频率及CD4⁺/CD8⁺比值与EB-DNA载量呈负相关(P < 0.001, P < 0.001, P < 0.01, P < 0.001)。ROC曲线分析表明CD3⁺ T细胞、CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞频率和Treg细胞频率以及CD4⁺/CD8⁺比值均具有较好的预测疾病转归的价值。结论：传染性单核细胞增多症患儿外周血CD3⁺ T细胞频率和CD8⁺ T细胞频率与EB-DNA载量呈正相关；CD4⁺ T细胞频率、CD19⁺ B细胞频率、Treg细胞频率和CD4⁺/CD8⁺比值与EB-DNA载量呈负相关，对预测疾病转归具有较好的临床意义。

Abstract: Objective: To investigate the distribution characteristics of peripheral blood lymphocyte subsets and their correlation with Epstein-Barr virus DNA (EB-DNA) load in children with infectious mononucleosis (IM). Methods: A total of 45 children with IM who were treated in the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University were enrolled. According to the EB-DNA load, they were divided into the low viral load group (<10⁵ copies/mL, n = 22) and the high viral load group (≥10⁵ copies/mL, n = 23). The distribution of peripheral blood lymphocyte subset percentages and their correlation with EB-DNA load were analyzed. Receiver operating characteristic (ROC) curves were used to evaluate the predictive value of peripheral blood lymphocyte subsets for disease outcome. Results: Compared with the low viral load group, the high viral load group showed significantly increased frequencies of CD3⁺ T cells and CD8⁺ T cells (P < 0.01, P < 0.001); significantly decreased frequencies of CD4⁺ T cells, CD19⁺ B cells, and regulatory T cells (Treg), as well as a significantly reduced CD4⁺/CD8⁺ ratio (P < 0.01, P < 0.05, P < 0.05, P < 0.01); while no significant difference was observed in the frequency of CD3⁻CD16⁺CD56⁺ natural killer (NK) cells (P > 0.05). Pearson correlation analysis revealed that the frequencies of CD3⁺ T cells and CD8⁺ T cells were positively correlated with EB-DNA load (P < 0.001, P < 0.001); the frequencies of CD4⁺ T cells, CD19⁺ B cells, and Treg cells, as well as the CD4⁺/CD8⁺ ratio, were negatively correlated with EB-DNA load (P < 0.001, P < 0.001, P < 0.01, P < 0.001). ROC curve analysis indicated that the frequencies of CD3⁺ T cells, CD4⁺ T cells, CD8⁺ T cells, and Treg cells, as well as the CD4⁺/CD8⁺ ratio, all had good value in predicting disease outcome.Conclusion: In children with IM, the frequencies of peripheral blood CD3⁺ T cells and CD8⁺ T cells are positively correlated with EB-DNA load; the frequencies of CD4⁺ T cells, CD19⁺ B cells, and Treg cells, as well as the CD4⁺/CD8⁺ ratio, are negatively correlated with EB-DNA load, which have good clinical significance for predicting disease outcome.

1. 引言

传染性单核细胞增多症(Infectious mononucleosis, IM)是一种自限性、儿科常见的急性感染性疾病，大多数患儿预后良好，但部分患儿会有多脏器受累的现象发生，进一步引发肝炎、脾破裂以及噬血综合征等并发症，少数患儿可进展为重症IM，严重者影响预后[1] [2]。EB病毒(EBV)是一种双链DNA病毒，原发性EB病毒感染通常发生在儿童早期，无症状。如果延迟到青春期或更晚，它可能与传染性单核细胞增多症的临床综合征有关，这种疾病的主要特征是发热、咽炎、淋巴结肿大和不适，该病毒在人类宿主中建立终生潜伏期，并善于逃避宿主先天性和适应性免疫反应[3]。有研究报道淋巴细胞亚群的数量表型等免疫学特征与EBV感染相关性疾病的发生发展及治疗预后相关[4]-[7]。因此，本研究对在我院就诊的45例IM患儿的外周血EB病毒载量和淋巴细胞亚群分布特征及其相关性进行了回顾性分析，旨在探讨IM患儿外周血淋巴细胞亚群分布特征，及其与EB病毒载量的相关性分析和对疾病转归的预测价值。

2. 材料和方法

2.1. 一般资料

选取在安徽医科大学第二附属医院就诊的IM患儿45例，其中男26例，女19例，年龄范围1.3~10.3岁，平均年龄(4.9 ± 2.2)岁。传染性单核细胞增多症诊断符合临床和实验室诊断标准[8]。

2.2. 标本采集

抽取传染性单核细胞增多症患儿外周血EDTA抗凝血，采血后立即颠倒混匀8~10次，用于外周血EB病毒DNA和淋巴细胞亚群的检测。

2.3. 检测方法

2.3.1. 流式细胞术检测淋巴细胞亚群

向15 ml离心管中加2 ml淋巴细胞分离液，再加3 ml抗凝血，800 g离心20 min，吸取血清和分离液中间的一层，加入适量磷酸盐缓冲液(PBS)，350 g离心5 min，弃去上清收集细胞沉淀，适量PBS重悬制备淋巴细胞悬液。向分选的淋巴细胞中加入相应抗体避光孵育15~20 min，洗涤后利用流式细胞仪检测。检测方法严格按照试剂说明书进行。仪器检测前需进行清洗并依照通道进行调试。

2.3.2. 外周血单核细胞EB病毒DNA检测

EB病毒DNA检测试剂盒购自苏州天隆生物科技有限公司，检测方法为实时荧光定量聚合酶链反应，由实时荧光定量PCR仪(ABI QuantStudio5)扩增完成，操作严格按照SOP文件进行，EB病毒DNA检测线性范围：1.0E+3~1.0E+8 copies/mL。

2.4. 统计方法

采用SPSS 27.0软件分析数据，连续变量根据是否符合正态分布，正态分布的数据使用t检验进行比较，否则采用Mann-Whitney U检验。Pearson相关性分析淋巴细胞亚群频率与EB病毒载量的相关性，采用ROC曲线评估淋巴细胞亚群对IM患儿疾病转归的预测价值。P < 0.05被认为差异具有统计学意义。

3. 结果

3.1. IM患儿EB-DNA不同载量淋巴细胞亚群的比较

45例IM患儿依据EB-DNA载量[9]分为低病毒载量组(<10⁵ copies/mL) 22例，占比48.9%；高病毒载量组(≥10⁵ copies/mL)患者23例，占比51.1%。如图1所示，高病毒载量组IM患儿与低病毒载量组相比，淋巴细胞亚群中CD3⁺ T细胞频率和CD8⁺ T细胞频率明显上升(P < 0.01, P < 0.001)；CD4⁺ T细胞频率、CD19⁺ B细胞频率、CD4⁺CD25⁺CD127^low Treg细胞频率和CD4⁺/CD8⁺比值显著降低(P < 0.01, P < 0.05, P < 0.05, P < 0.01)；CD3^-CD16⁺CD56⁺ NK淋巴细胞频率则无显著性差异(P > 0.05)。

(A) (B) (C)

(A) 不同EB病毒载量T、B、NK淋巴细胞亚群频率比较；(B) 不同EB病毒载量Treg淋巴细胞频率比较；(C) 不同EB病毒载量CD4⁺/CD8⁺比值的比较。^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure 1. Distribution characteristics of lymphocyte subset frequencies in children with IM

图1. IM患儿淋巴细胞亚群频率分布特征

3.2. IM患儿EB-DNA载量与淋巴细胞亚群的相关性分析

(A) (B) (C)

(D) (E) (F)

传染性单核细胞增多症患者EB-DNA载量与CD3⁺ T细胞频率(A)，CD4⁺ T细胞频率(B)，CD8⁺ T细胞频率(C)，CD19⁺ B细胞频率(D)，CD4⁺/CD8⁺比值(E)和调节性T细胞Treg频率(F)的相关性。

Figure 2. Correlation analysis between EBV-DNA load and lymphocyte subset frequencies

图2. EB-DNA载量与淋巴细胞亚群频率的相关性分析。

IM患儿EB-DNA载量与CD3⁺、CD8⁺ T细胞频率呈正相关(r = 0.5882, P < 0.001; r = 0.6276, P < 0.001)；与CD4⁺ T细胞频率、CD19⁺B细胞频率、CD4⁺/CD8⁺比值、CD4⁺CD25⁺CD127^low Treg细胞频率呈负相关(r = −0.5589, P < 0.001; r = −0.6186, P < 0.001; r = −0.6222, P < 0.001; r = −0.4332, P < 0.01)，见图2。

3.3. 外周血淋巴细胞亚群频率对传染性单核细胞增多症疾病转归的预测价值

采用ROC曲线分析评估外周血淋巴细胞亚群频率对传染性单核细胞增多症疾病转归的预测价值。其中CD3⁺ T细胞频率曲线下面积为0.7406，CD4⁺ T细胞频率曲线下面积为0.7669，CD8⁺ T细胞频率曲线下面积为0.7870，CD4⁺/CD8⁺比值曲线下面积为0.7469，CD4⁺CD25⁺CD127^lowTreg细胞频率曲线下面积为0.6692，CD3⁺ T细胞频率、CD4⁺/CD8⁺比值和Treg细胞频率联合曲线下面积为0.9348 (图3和表1)。因此，T淋巴细胞亚群联合检测优于各单项指标，具有较好地预测疾病转归的临床价值。

(A) (B) (C)

(D) (E) (F)

CD3⁺ T细胞频率(A)，CD4⁺ T细胞频率(B)，CD8⁺ T细胞频率(C)，CD4⁺/CD8⁺比值(D)和调节性T细胞Treg频率(E)以及联合组(F)对传染性单核细胞增多症疾病转归的预测价值，其中联合组包括CD3⁺ T细胞频率、CD4⁺/CD8⁺比值和Treg细胞频率。

Figure 3. ROC curves of T lymphocyte subsets for predicting disease outcomes in children with IM

图3. T淋巴细胞亚群预测IM患儿疾病转归的ROC曲线

Table 1. Area under the ROC curve of T lymphocyte subsets for predicting disease outcomes in children with IM

表1. T淋巴细胞亚群预测IM患儿疾病转归的ROC曲线下面积

检测指标	AUC	95% CI	P
CD3^+ T细胞	0.7406	0.5809~0.9003	0.0093
CD4^+ T细胞	0.7669	0.6149~0.9189	0.0039
CD8^+ T细胞	0.7870	0.6384~0.9355	0.0019
CD4^+/CD8^+比值	0.7469	0.5875~0.9063	0.0076
CD4^+CD25^+CD127^low/CD4^+ Treg细胞	0.6692	0.4987~0.8396	0.0675
联合检测	0.9348	0.8530~1.0000	< 0.001

注：联合检测包括CD3⁺ T细胞、CD4⁺/CD8⁺比值和 CD4⁺CD25⁺CD127^low/CD4⁺ Treg。

4. 讨论

EB病毒是导致传染性单核细胞增多症(IM)的嗜淋巴细胞病毒[10] [11]。有研究[12]表明，IM症状可能与激活增殖的CD8⁺ T淋巴细胞对病毒的免疫应答有关，而非病毒感染本身所导致。此外，也有研究[13]显示IM中EB-DNA载量与CD8⁺ T淋巴细胞表达呈正相关，可能是高病毒载量激活CD8⁺ T淋巴细胞的增殖有关。亦有研究[14]验证T细胞中的高EBV DNA载量可以作为EBV-相关噬血细胞综合症发展的潜在预测因子。本研究主要分析了外周血淋巴细胞亚群与IM患儿EB-DNA载量之间的相关性及其对疾病转归的预测价值。研究表明EB病毒载量与IM患儿疾病严重程度密切相关。CD3⁺ T细胞频率，CD4⁺ T细胞频率，CD8⁺ T细胞频率，CD4⁺/CD8⁺比值和调节性T细胞Treg频率联合检测能够很好地预测病毒学指标EB-DNA载量，进而用于临床预判IM患儿病情转归情况，指导临床治疗。

一般情况下，EBV主要通过CD21受体感染B淋巴细胞，感染B淋巴细胞后，进一步引起CD4⁺和CD8⁺ T淋巴细胞增殖。现有研究表明，EBV感染的免疫控制主要依赖于细胞免疫反应，尤其是CD8⁺ T细胞的细胞毒作用。外周血中CD8⁺ T细胞的频率与EBV载量呈正相关，而B淋巴细胞和CD4⁺ T淋巴细胞的频率则与EBV载量呈负相关[15]。CD4⁺ 和CD8⁺ T淋巴细胞各自发挥作用，CD4⁺ T淋巴细胞借助细胞因子调节炎症反应，CD8⁺ T淋巴细胞通过细胞毒作用杀伤被感染的B淋巴细胞，CD4⁺ /CD8⁺ T淋巴细胞比值反映机体的免疫水平，比值降低提示机体免疫功能减弱[16]-[18]，因此认为细胞免疫对EB病毒感染起决定性作用[19] [20]。本研究中已经证实了IM患儿高病毒载量组CD3⁺ T淋巴细胞频率、CD8⁺ T淋巴细胞频率显著上调，提示患儿EB病毒感染后机体T淋巴细胞发生剧烈免疫反应；CD4⁺ T淋巴细胞、CD4⁺ /CD8⁺明显下降，说明机体细胞免疫功能下降。近年来有文献报道了Treg细胞的新标志物CD4⁺ CD25⁺ CD127low细胞在IM患儿外周血中比例明显下降，该现象涉及多因素共同作用，可能伴随功能耗竭和凋亡增加，也可能因向病灶组织迁移在外周血中比例降低，需进一步实验验证，这表明它可能与IM疾病的发生和发展有关[21]-[24]。同时本文结果也显示Treg细胞与 EB-DNA载量呈负相关，可见患儿机体感染EB病毒时Treg细胞在病毒清除以及维持机体稳定过程中发挥了重要作用。

综上所述，EBV病毒载量与淋巴细胞亚群存在相关性，CD3⁺ T淋巴细胞、CD4⁺/CD8⁺比值和Treg细胞频率联合检测可用于临床预判IM患儿疾病转归。IM疾病发生发展过程中，可借助淋巴细胞亚群分析判断机体的免疫应答，预判疾病转归。治疗过程中，在使用抗病毒治疗的同时，依据机体免疫状况加强免疫疗法，从而更有利于疾病转归。

基金项目

本研究获得安徽医科大学第二附院医院医学伦理委员会批准(审批号：2023-036)。

NOTES

^*通讯作者。