蛋氨酸铬对锦鲤生长、血液生化及肝胰脏部分免疫指标的影响

Effects of Chromium Methionine on Growth, Serum Biochemical Parameters and Partial Immune Indices in the Hepatopancreas of Ornamental Carp

摘要: 为研究饲料中添加不同水平蛋氨酸铬对锦鲤生长及部分血液、肝胰脏生化指标的影响，选用540尾规格一致(初始体重为23.19 ± 1.80 g)、体质健壮的锦鲤。随机分为6个处理组，每组设置3个重复，每个重复30尾。Cr³⁺添加量分别为0、0.2、0.4、0.8、1.6 mg/kg和3.2 mg/kg，饲养56 d。结果表明：与0 mg/kg相比，添加不同水平的蛋氨酸铬对锦鲤的增重率、特定生长率、饲料效率以及蛋白质效率均无显著差异(P > 0.05)；铬添加量为0.4~0.8 mg/kg时，试验鱼血清中GLU、TG、TC含量，GPT、GOT活性以及肝胰脏中MDA含量均显著低于0 mg/kg组，而SOD、CAT以及GSH-Px活性显著高于0 mg/kg组(P < 0.05)；肝胰脏中AKP活性仅在0.8 mg/kg组显著低于0 mg/kg (P < 0.05)，与其余试验组间无显著差异(P > 0.05)。综上所述，铬添加量为0.8 mg/kg时，能够提高锦鲤幼鱼非特异性免疫力。

Abstract: A 56-day feeding trial was conducted to study the effects of chromium methionine on growth, some biochemical indices of blood and hepatopancreas in ornamental carp. A total of 540 growing red-white ornamental carps with similar weight (23.19 ± 1.80 g) and heavily built were divided into six groups randomly. The supplemental Cr³⁺ levels were 0, 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, and 3.2 mg/kg, respectively. The results showed that, compared with the 0 mg/kg group, supplementation with different levels of chromium methionine had no significant effects on the weight gain rate, specific growth rate, feed efficiency, or protein efficiency of ornamental carp (P > 0.05). When the chromium supplementation level ranged from 0.4 to 0.8 mg/kg, the serum levels of GLU, TG, and TC, the activities of GPT and GOT, and the hepatopancreas MDA content were significantly lower than those in the 0 mg/kg group (P < 0.05), while the activities of SOD, CAT, and GSH-Px were significantly higher than those in the 0 mg/kg group (P < 0.05). The hepatopancreas AKP activity was significantly lower only in the 0.8 mg/kg group compared with the 0 mg/kg group (P < 0.05), and no significant differences were observed among the other treatment groups (P > 0.05). In conclusion, dietary supplementation with 0.8 mg/kg chromium (as chromium methionine) can enhance the non-specific immunity of juvenile ornamental carp.

1. 前言

碳水化合物是一种成本低廉的重要能量来源。鱼类对碳水化合物的利用效率普遍较低，若能以经济高效的碳水化合物部分替代蛋白质，实现“蛋白质节约效应”，则有望在降低饲料蛋白质用量与成本的同时，减轻对渔业资源的依赖，并减少养殖水体中氮污染物的排放。

三价铬(Cr³⁺)是动物体内的必需痕量元素之一，可通过增强胰岛素活性，参与碳水化合物、脂质、蛋白质和核酸的代谢[1]。已有研究证明，Cr³⁺能有效提高、拟穴青蟹(Scylla paramamosain) [2]、锦鲤(Cyprinus carpio) [3]等的糖利用力，还能改善乌鳢(Channa argus) [4]、罗非鱼(Oreochromis niloticus) [5]等的生长性能，调节脂质代谢[6]，并且能增强凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei Boone) [7]、鲤鱼(Cyprinus carpio) [8]等的免疫功能。因此，Cr³⁺已被广泛应用于畜禽饲料中，并且是一种潜在的水产动物饲料添加剂。

锦鲤(Cyprinus carpio)体色艳丽，享有“会游泳的艺术品”美称，广受消费者欢迎。本试验前期研究了葡萄糖酸铬对其生长、激素、糖利用力及抗氧化性能等的影响[3] [9]。现有研究发现，蛋氨酸(Methionine, Met)是维持机体正常生理功能所必需的氨基酸，兼具多种生物活性，可作为铬的天然配位体及高效的自由基清除剂。以其为配体形成的铬螯合物用作饲料添加剂时，可进一步提高铬的吸收率与生物利用度。基于此，本研究拟在高糖饲料中添加(Chromium Methionine, CrMet)，通过检测生长、血液生理生化指标及肝胰脏抗氧化力，评估CrMet对摄食高糖饲料的锦鲤生长、健康的作用，以期为CrMet在锦鲤饲料中的合理应用提供参考。

2. 材料与方法

2.1. 试验饲料

以酪蛋白、明胶为蛋白源，鱼油为脂肪源，糊精为糖源，蛋氨酸铬为铬源，配制6种不同纯化饲料，Cr³⁺添加水平分别为0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/kg。其中，蛋氨酸铬购自美国金宝公司的氨维乐铬(铬含量为1‰)。所有饲料原料均过80目标准筛，逐级混匀后，用双螺杆制粒机(华南理工大学机械工程研究所制造)制成颗粒饲料，自然风干后保存备用(表1)。

Table 1. Formulation and composition of the experimental diets

表1. 试验饲料配方及常规成分分析

原料组成	0 mg/kg	0.2 mg/kg	0.4 mg/kg	0.8 mg/kg	1.6 mg/kg	3.2 mg/kg
酪蛋白	36	36	36	36	36	36
明胶	9	9	9	9	9	9
鱼油	6	6	6	6	6	6
预混物	4	4	4	4	4	4
氯化胆碱	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
微晶纤维素	6	6	6	6	6	6
羧甲基纤维素钠	2	2	2	2	2	2
磷酸二氢钙	1.8	1.8	1.8	1.8	1.8	1.8
糊精	35	35	35	35	35	35
Cr^3+ (mg·kg^−^1)	0	0.2	0.4	0.8	1.6	3.2

注：预混料为每千克饲料提供：VA 600,000 IU，VD 3,200,000 IU，VE 6000 mg，VK 31,000 mg，VB 1900 mg，VB 2900 mg，VB 6750 mg，VB 123 mg，VC 9000 mg，D-生物素D-biotin 15 mg，D-泛酸D-pantothenic acid 3000 mg，叶酸folic acid 300 mg，烟酰胺nicotinamide 4500 mg，肌醇inositol 8000 mg，Fe 14,000 mg，Cu 350 mg，Zn 4000 mg，Mg 10,000 mg，Co 25 mg，I 50 mg，Se 30 mg，Me，1500 mg，乙氧基喹啉Ethoxyquin 500 mg。

2.2. 试验鱼及饲养管理

饲养试验在天津市西青区益利来养殖有限公司进行。选用540尾初始体重(23.19 ± 1.80 g)的健康锦鲤幼鱼，暂养7 d，期间投喂基础饲料(不添加Cr³⁺)，暂养结束后，将试验鱼随机分为6个处理，每处理3个重复，每重复30尾幼鱼，分别放养于18个饲养箱中，养殖模式为静水养殖，每天投喂两次(09:00, 17:00)，日投喂量为体重的3%~4%，喂食1h后吸出残余饵料避免影响水质，每周换水两次，换水量是饲养箱水量的1/3~2/3。饲养期间水温为15℃~25℃，Ph 7.6~7.8，氨氮浓度 ≤ 0.05mg/L，溶解氧浓度 ≥ 6.1 mg/L，试验周期为56 d。

2.3. 样品采集

经56 d饲养后，试验鱼禁食24 h，测量体长、体重，计算生长指标。每箱随机挑选3尾锦鲤并在尾部采血，4℃静置8 h，而后在4℃，4500 r/min下离心10 min，取上清液，置于−80℃冰箱保存，以备检测血液生化指标。另取3尾试验鱼，取全血后于冰盘解剖取其肝胰脏，立即放入液氮中速冻，后转入−80℃超低温冰箱中保存，用于检测肝胰脏抗氧化指标。

2.4. 测定指标

2.4.1. 生长指标的测定

成活率(SR)/% = (终末鱼尾数)/(初始鱼尾数) * 100；

增重率(WGR)/% = [(W_t − W₀) − W₀] * 100；

饲料效率(FE) = (W_f + W_d − W₀)/C；

特定生长率(SGR) = [(lnW_t − lnW₀)/t] * 100；

蛋白质效率(PER) = (W_t − W₀)/C_p；

肥满度CF = (W/L³) × 100。

式中，W_t为试验鱼终末体重，g；W₀为试验鱼初始体重，g；t为试验持续天数，d；C为摄饵采食量；W_f为试验鱼终末总重；W_d为死亡试验鱼总重；W为体重，g；C_P为蛋白质摄入量；L为体长，cm。

2.4.2. 血液指标的测定

葡萄糖(Glucose, GLU)、甘油三酯(Triglyceride, TG)、总胆固醇(Total Cholesterol, TC)、谷丙转氨酶(Glutamic-Pyruvic Transaminase, GPT)和谷草转氨酶(Glutamic-Oxalacetic Transaminease, GOT)测定均采用南京建成生物工程研究所购买的试剂盒进行测定。

2.4.3. 肝胰脏免疫指标的测定

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)、丙二醛(Malondialdehyde, MDA)、过氧化氢酶(Catalase, CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase, GSH-Px)、蛋白定量测试盒(Total serum Protein, TP)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, AKP)、酸性磷酸酶(Acid Phosphatase, ACP)的测定均采用南京建成生物工程研究所购买的试剂盒进行测定。

2.5. 数据统计分析

试验数据用Excel表计算，并用平均值 ± 标准差(Mean ± SD)来进行数据的表示。采用SPSS 26.0对试验数据进行单因素方差分析(ANOVA)，若差异显著(P < 0.05)，则进行Duncan’s多重比较分析。

3. 结果与分析

3.1. 饲料中添加CrMet对锦鲤生长性能的影响

Table 2. Effects of different CrMet supplementation levels on growth performance of juvenile Ornamental Carp

表2. 不同CrMet添加量对锦鲤幼鱼生长性能的影响

组别	0 mg/kg	0.2 mg/kg	0.4 mg/kg	0.8 mg/kg	1.6 mg/kg	3.2 mg/kg
WGR/%	48.42 ± 5.36	59.93 ± 1.89	58.64 ± 7.00	59.86 ± 4.43	58.16 ± 1.00	53.46 ± 4.19
SGR/%	1.16 ± 0.17	1.27 ± 0.03	1.24 ± 0.12	1.20 ± 0.12	1.12 ± 0.21	1.16 ± 0.07
SR/%	93.33 ± 6.67	95.56 ± 3.85	97.78 ± 3.85	95.56 ± 7.70	95.56 ± 3.85	93.33 ± 6.67
FE/%	0.44 ± 0.08	0.49 ± 0.02	0.48 ± 0.07	0.47 ± 0.05	0.47 ± 0.05	0.44 ± 0.04
PER/%	1.16 ± 0.20	1.30 ± 0.06	1.27 ± 0.18	1.24 ± 0.13	1.24 ± 0.03	1.17 ± 0.15
CF (g/cm^3)	2.21 ± 0.19	2.23 ± 0.10	2.27 ± 0.04	2.31 ± 0.23	2.45 ± 0.09	2.35 ± 0.10

饲喂56 d后，各处理试验鱼的存活率为93.33%~97.78%，组间无显著差异(P > 0.05)。不同CrMet水平对锦鲤生长指标的影响见表2。由表可知，饲料中CrMet水平对试验鱼的增重率、特定增长率、饲料效率、蛋白质效率以及肥满度均无显著影响(P > 0.05)。

3.2. 饲料中添加CrMet对锦鲤血液生化指标的影响

血液生化指标的检测结果如表3，不同CrMet添加水平对锦鲤GLU、TG、TC含量，GOT和GPT活性影响显著(P < 0.05)。随CrMet添加量的升高，上述指标均呈现先降低再升高的趋势，添加CrMet的各试验组GLU、TG含量均显著低于0 mg/kg组(P < 0.05)，0.2~1.6 mg/kg组的TG含量显著低于0 mg/kg组(P < 0.05)。GOT活性在0.4~1.6 mg/kg组时显著低于0 mg/kg组，而GPT活性仅在0.4~0.8 mg/kg组显著降低(P < 0.05)。

Table 3. Effects of different CrMet supplementation levels on biochemical parameters in serum of juvenile Ornamental Carp

表3. 不同CrMet添加量对锦鲤幼鱼血清生化指标的影响

组别	0 mg/kg	0.2 mg/kg	0.4 mg/kg	0.8 mg/kg	1.6 mg/kg	3.2 mg/kg
GLU (mmol·L^−^1)	5.76 ± 0.04^d	4.59 ± 0.17^b	4.4 ± 0.08^a	4.76 ± 0.06^b	5.25 ± 0.06^c	5.34 ± 0.11^c
TC (mmol·L^−^1)	8.21 ± 0.79^c	7.36 ± 0.58^c	5.72 ± 0.82^b	3.79 ± 0.43^a	4.53 ± 0.88^ab	5.24 ± 0.58^b
TG (mmol·L^−^1)	1.42 ± 0.04^b	1.1 ± 0.08^a	1.05 ± 0.07^a	1.08 ± 0.03^a	1.1 ± 0.06^a	1.32 ± 0.11^b
GPT (U·L^−^1)	9.85 ± 0.07^a	8.07 ± 0.75^ab	7.02 ± 0.66^b	6.84 ± 0.21^b	7.80 ± 0.87^ab	8.38 ± 0.81^ab
GOT (U·L^−^1)	13.91 + 0.12^a	12.41 ± 1.05^ab	10.87 ± 0.32^b	8.20 ± 0.81^c	11.15 ± 0.64^b	12.52 ± 0.76^ab

注：同行不同小写字母表示有显著差异(P < 0.05)，下表同。

3.3. 饲料中添加CrMet对锦鲤肝胰脏部分免疫指标的影响

不同CrMet水平对锦鲤肝胰脏抗氧化指标的影响见表4，由表可知，SOD、CAT、GSH-Px、AKP以及ACP活性均随CrMet添加水平的升高呈现递增再降低的趋势，而MDA含量以及AKP活性呈现与之相反的变化趋势。除3.2 mg/kg外，其余各试验组的MDA含量均显著低于0 mg/kg (P < 0.05)，而AKP活性仅在0.8 mg/kg组显著低于0 mg/kg (P < 0.05)。Cr³⁺水平 ≥ 0.4 mg/kg时，各组SOD和CAT活性均显著高于0 mg/kg，GSH-Px活性在0.4~1.6 mg/kg组显著升高(P < 0.05)，而各组间ACP活性均无显著差异(P > 0.05)。

Table 4. Effects of different CrMet supplementation levels on antioxidant-related parameters in hepatopancreas of juvenile Ornamental Carp

表4. 不同水平蛋氨酸铬对锦鲤幼鱼肝胰脏抗氧化指标的影响

组别	0 mg/kg	0.2 mg/kg	0.4 mg/kg	0.8 mg/kg	1.6 mg/kg	3.2 mg/kg
SOD (U/mgprot)	189.91 ± 3.01^a	207.66 ± 2.44^ab	248.46 ± 14.93^c	290.24 ± 30.7^d	247.04 ± 13.86^c	229.37 ± 2.6b^c
CAT (U/mgprot)	32.39 ± 2.59^a	38.11 ± 1.4^ab	40.65 ± 3.14^b	72.28 ± 1.64^e	59.1 ± 4.7^d	49.9 ± 6.6^c
GSH-Px (U/mgprot)	51.91 ± 1.01^a	62.61 ± 10.6^ab	84.25 ± 0.48^c	85.7 ± 0.44^c	76.06 ± 20.23^bc	68.11 ± 10.67^ab
MDA (nmol/mgprot)	3.75 ± 0.39^d	2.32 ± 1.07^bc	1.78 ± 0.2^ab	1.14 ± 0.15^a	1.42 ± 0.16^ab	3.11 ± 0.28^cd
AKP (U/gprot)	19.71 ± 0.60^a	18.02 ± 1.21^ab	16.33 ± 0.58^ab	15.61 + 0.10^b	19.28 ± 1.41^a	19.65 ± 0.87^a
ACP (U/gprot)	9.25 + 0.65	8.90 + 0.63	11.04 + 0.45	11.14 + 0.10	10.42 + 0.59	8.94 + 0.29

4.讨论

4.1. 饲料中添加蛋氨酸铬对锦鲤生长的影响

Cr³⁺因双重生物学效应，其对动物体健康的影响仍存争议。已有研究表明，饲料中适量添加Cr³⁺可有效促进多种水生动物的生长性能，而过量添加则产生抑制作用，在对鲈鱼[10]、团头鲂[11]、乌鳢[4]、罗非鱼[5]以及罗氏沼虾[12]的研究中均发现上述情况。本研究中，添加蛋氨酸铬(CrMet)后，未对锦鲤的生长性能产生显著影响，该结果与我们前期在高糊精饲料中添加CrMet未对鲤鱼[13]生长造成影响的研究结果相一致。而以葡萄糖为糖源时，饲料中添加适宜水平的CrMet则能显著改善鲤的生长性能[14]。造成此类差异的原因涉及铬源类型、养殖物种、生理状态及养殖模式等多种因素。同时，不同物种对碳水化合物的代谢能力以及同一物种对不同碳水化合物的利用差异，均可能影响铬的生物学效应。

4.2. 饲料中添加蛋氨酸铬对锦鲤血液生化指标的影响

Cr³⁺能够通过提高机体胰岛素的内化率，加速骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取，从而降低血液循环中的血糖含量，我们前期研究了不同形式铬对摄食高糖饲料后鲤的血糖变化情况，证实无论是有机铬(CrMet、CrPic)、还是无机铬(Cr₂O₃)均具有良好的降糖效果[15]。类似的结果也出现在本研究中，添加适宜水平的CrMet能有效改善锦鲤的血糖含量，其原因可能是Cr³⁺能够促进血液中葡萄糖的清除，缩短其半衰期，从而降低循环葡萄糖水平。TC、TG是血液中主要的脂类物质，Cr³⁺在脂代谢中的一个重要作用是协助维持血液胆固醇稳态。对鲤鱼的研究发现，在以葡萄糖为主要糖源的高糖饲料中添加CrMet可显著降低鲤的血清中脂类含量，改善其脂类代谢[15]。而在以糊精为主要糖源的高糖饲料中添加CrMet未对血清TG和T-CHO含量产生显著影响，但显著提高了血清高密度脂蛋白(HDL)水平，降低了低密度脂蛋白(LDL)水平，说明Cr³⁺可能促进了LDL向HDL的转化，进而对肝脏健康发挥保护作用。本试验中，适宜水平的CrMet也显著降低了锦鲤血清中TG、TC含量，上述结果提示，除试验条件等环境因素外，不同物种对碳水化合物的代谢能力，或同一物种对不同种类的碳水化合物代谢能力均影响其生物学效应[13]。血清转氨酶(GOT/GPT)活性上升是肝组织损伤的典型标志[16]。已有研究证实，长期摄食高碳水化合物(HCD)日粮会引起鱼类肝糖原过度蓄积，继而损害肝细胞功能并诱发肝脏病变[17]。Zhou等[18]在凡纳滨对虾中的研究证实，饲料中添加1.35 mg·kg⁻¹ Cr³⁺可降低血清GOT与GPT活性，有效改善肝胰腺健康状态。本研究中，在HCD中补充CrMet后，锦鲤血清GOT和GPT活性均显著下降，说明CrMet可有效缓解高糖饲料诱导的肝胰脏损伤。

4.3. 饲料中添加蛋氨酸铬对锦鲤肝胰脏部分免疫指标的影响

生物体的健康状态与其抗氧化防御系统功能紧密相关。该系统通过清除过量活性氧(ROS)及羟自由基(∙OH)，有效保护细胞和组织免受氧化应激损害[19]。内源性抗氧化酶(如T-SOD、CAT和GPX)可中和ROS [20]，而丙二醛(MDA)作为脂质过氧化产物，是评估细胞损伤程度的重要指标[21]。关于Cr³⁺对水生动物抗氧化功能的影响已有若干报道，如在罗氏沼虾的研究中发现，在饲料中添加纳米铬可有效提高其肝胰腺的抗氧化酶活性[22]。对团头鲂幼鱼的研究也发现，Cr³⁺能显著诱导热应激条件下的GSH-Px、T-SOD、CAT活性及相关基因表达，有效缓解热应激导致的抗氧化功能下降[23]。类似的结果也出现在对乌鳢[4]中。本研究结果显示，Cr³⁺添加水平在0.4~1.6 mg/kg时显著提高了锦鲤抗氧化酶活性，同时降低了MDA含量，表明适宜水平的CrMet能有效增强摄食锦鲤的抗氧化能力，减轻高糖饲料引发的氧化损伤，与上述研究相类似。

AKP与ACP是蛋白酶去磷酸化过程的关键参与者[24]。研究表明，当机体免疫受损时，这两种酶的活性会异常升高。对鲤的研究证实，HCD喂养诱导了鲤AKP和转氨酶活性的异常升高，而CrMet补充有效改善了这一情况[13]。本试验与上述结果相一致，添加适宜水平的Cr³⁺能有效降低AKP以及转氨酶的活性，证实CrMet能有效改善HCD引起的肝脏免疫及代谢功能异常。

5. 结论

在高糖饲料中添加CrMet (以Cr³⁺计)能有效提高锦鲤肝胰脏抗氧化酶活性，降低血清脂质含量和转氨酶活性，缓解高糖饲料带来的负面效应，0.8 mg/kg Cr³⁺为最适添加水平。

基金项目

天津市教委项目(项目编号：2019KJ033)。

NOTES

^*通讯作者。