尿素通道蛋白B的转运特性

Transport Characteristics of Urea Transporter-B

摘要: 尿素通道蛋白B(urea transporters B, UT-B)主要表达在红细胞和一些上皮及内皮细胞膜，介导尿素的跨膜转运。近年来研究发现UT-B亦参与其他物质的转运，如水、NH₃和尿素类似物等，提示UT-B还可以作为水和气体通道。本文主要阐述UT-B对这些物质的转运特性，并探究其可能的生理学意义。 Urea transporter UT-B is highly expressed in the membrane of erythrocytes and some epithelial and endothelial cells, in which UT-B facilitates urea transport. Recently, studies find that water, ammonia and urea analogues can also be transported by UT-B. This review mainly focuses on the transport characteristics of UT-B, and the possible physiological significance will be discussed as well.

1. 引言

尿素通道蛋白(Urea Transporter, UT)是特异性通透尿素的跨膜蛋白，介导尿素在浓度差驱动下快速穿过细胞膜，其速度是简单扩散的10~100倍。哺乳动物的UT家族目前有7个成员，分为UT-A和UT-B两个亚家族，UT-A1-6由SLC14A2编码，UT-B由SLC14A1编码，串联位于18号染色体的q12-21之间，他们具有高度的同源性^[1-3]。近年来的研究主要集中在利用转基因小鼠模型阐明尿素通道蛋白转运的分子和细胞机制，并取得了新的进展。随着研究的深入，人们发现UT-B不仅能特异性地通透尿素，对尿素类似物、NH₃和水等也具有良好的通透性。

2. UT-B介导的尿素转运

尿素是蛋白质代谢的主要终产物，也是尿液的主要溶质成分。红细胞膜和肾集合管末段对尿素的通透性远远高于脂相单纯扩散。早在1970年，Hunter发现并证实了人红细胞膜尿素的转运具有饱和现象^[4]。Macey和Farmer发现根皮素可以显著抑制红细胞膜对尿素的转运而对水的转运影响甚微^[5]。随后，Wieth等人证明了硫脲和尿素的之间的转运存在竞争^[6]。这些研究均表明人红细胞对尿素的转运类似易化扩散转运。在随后的30年，人们对哺乳动物红细胞膜介导的尿素的转运进行了深入的研究。研究结果提示尿素跨膜转运由特殊的膜通道蛋白介导。1993年Hediger等人^[7]首次应用爪蟾卵母细胞表达系统克隆出尿素通道蛋白的cDNA，该蛋白被称为UT-A2。随后，Oliver等人^[8]根据UT-A2 cDNA序列，以同源克隆的方法从人骨髓cDNA文库中筛选出UT-B。UT-B亚家族主要表达于红细胞膜和肾脏的直小血管降支，能够快速、特异性地转运尿素，维持肾脏髓质的高尿素浓度梯度，保证肾脏直小血管逆流交换的进行。Yang等人^[9]首次建立了UT-B基因敲除小鼠模型，发现与野生型小鼠相比，UT-B敲除的小鼠饮水量和排尿量大大增加，血浆中尿素的浓度升高了30%且尿液浓缩能力降低了50%，而非尿素溶质浓度未发生明显变化。2004年，Bankir等人^[10]检测了野生型小鼠与UT-B敲除小鼠各项生理指标的变化，发现在正常情况下UT-B敲除小鼠其血浆尿素浓度升高了44%，肌酐清除率不变，而尿素的清除率下降了25%。在急性尿素负荷条件下，野生型小鼠的尿液中尿素的浓缩逐渐增加，随后其尿浓缩能力恢复正常。而在UT-B敲除小鼠中，因髓质尿素的聚集受损，其尿液的渗透压和尿液中尿素的浓缩均上升。随着蛋白饮食量的增加，UT-B敲除小鼠的血浆尿素浓度增加而野生型小鼠血浆尿素浓度不变，这些结果证实UT-B在肾脏逆流交换和尿浓缩机制中发挥重要作用，其作用机制是UT-B通过介导尿素从直小血管升支向降支的逆流交换。此外，红细胞通过髓质时可能会带走尿素进入血液循环，而UT-B可以防止皮质–髓质渗透梯度的逸散，还可预防红细胞穿过有尿素渗透梯度的髓质时发生有害的快速细胞皱缩和膨胀。

3. UT-B介导的尿素类似物转运

Yang等人^[11]利用停流实验方法对哺乳动物红细胞UT-B介导的尿素和尿素类似物的转运效率进行了比较。实验发现UT-B对甲酰胺、乙酰胺、甲基脲、甲基酰胺、氨基甲基脲、丙烯酰胺、羟基乙酰胺、羟基脲和碳酰肼的通透率高，对丁酰胺和异丁酰胺的通透率较低。本研究还发现二甲基脲和硫脲会抑制UT-B介导的尿素转运，该抑制作用是通过阻断UT-B的孔道而不是与尿素竞争UT-B。结果表明UT-B介导转运的化合物需要至少一个氨基，如甲酰胺、乙酰胺、氨基甲酸酯和丙烯酰胺均含氨基功能，其通过UT-B转运的效率高。N甲基化的酰胺其亲水能力下降，亲脂性和分子量增加，故转运效率较低。甘氨酸和乙酸也不具有氨基功能，故而不能经UT-B转运。这些结果表明UT-B能够有效地转运尿素类似物，其转运效率与尿素类似物的分子大小、氢键结合能力、亲脂性和极性等密切相关。

UT-B对尿素类似物的转运表明其可以作为一个选择特异性的亲水性转运通道。此外，某些尿素类似物能够显著抑制UT-B介导的尿素转运。

4. UT-B介导的NH₃转运

传统的观点认为气体分子的跨膜转运是气体首先溶解到细胞膜的脂质双分子层，然后由简单扩散穿过脂质层。该观点直到发现AQP1(Aquporin 1)能够通透CO₂才被推翻^[12,13]，AQP1是第一个被发现的气体通道。随后发现AQP1也能转运NH₃^[14]和NO^[15,16]。第二个被发现的气体通道是RhAG(Rhesus proteins)，可以转运CO₂^[17]和NH₃^[18]。但RhAG和AQP1介导CO₂和NH₃转运的生理学意义尚不能确定^[19,20]。随后，R. Ryan Geyer等人^[21]证实了人UT-B可以介导NH₃的转运，使得UT-B成为第三个气体通道家族。他们通过记录成像监测表达UT-B的卵母细胞对C¹⁴标记的尿素的吸收过程和水的渗透压，采用微电极记录卵母细胞暴露于5% CO₂/33 mM或0.5 mM NH₃/NH₄⁺中DpH的最大变化值。实验发现，表达UT-B的卵母细胞对尿素的通透性及水的通透性分别是对照组卵母细胞的20倍和8倍。同时，UT-B对CO₂诱导的DpH无影响，但NH₃诱导的DpH增加了两倍。根皮素使UT-B介导的尿素和水的通透性分别减少了45%和50%，对氯汞苯磺酸酯使尿素、水的通透性以及DpH分别减少了25%、30%和100%，这表明UT-B是一种对根皮素和对氯苯磺酸酯敏感的氨转运通道。他们还利用MD模拟计算H₂O渗透的自由能和US计算法计算NH₃渗透的自由能，发现在UT-B的Sm区域，H₂O通透单分子UT-B孔道的最大自由能仅~2 kcal/mol，NH₃ ~2.2 kcal/mol，这表明NH₃透过孔道的效率很高。Sm区域是UT-B孔道最狭窄的部分，也是屏障能量的主要来源，该屏障在室温低时易使这些分子通透。此外，他们对人UT-B的T177V和T399V位点进行突变，发现突变后水的通透性接近零，且NH₃的通透性也大大降低。同时，突变T339V能减少单分子尿素通道的直径从而阻止尿素、H₂O和NH₃的转运。这些结果表明这两个位点对UT-B介导的水和NH₃的转运至关重要。

作为气体通道，UT-B与AQP1和RhAG作用类似，均是作为NH₃的载体，UT-B对NH₃的通透性能增强红细胞在各组织中对NH₃的吸收，将其从NH₃的合成部位转运到肝脏脱毒。血浆NH₃浓度的轻微升高主要有两个原因：一是血浆尿素的聚集会减少肝脏消耗NH₃；另一个原因是血液中NH₃的有效分布容积减少。血浆NH₃浓度升高时，对肝外的组织具有很强的毒性作用。血浆中NH₃浓度超过0.7 mmol/L，可干扰脑的能量代谢及三羧酸循环，造成中枢神经系统功能障碍，严重者可致动物痉挛直至死亡^[22]。红细胞膜上的UT-B不仅能够作为NH₃的潜在载体，将其从合成部位转运至肝脏，并可通过一系列反应转化为尿素，从而避免NH₃浓度过高引起毒性作用。此外，在肾脏内髓，UT-B还可以减少尿素和NH₃的渗透系数，进而减少红细胞进出肾脏内髓的细胞体积的改变。

5. UT-B介导的水转运

一直以来人们认为水是以简单扩散的形式通过细胞的脂质双分子层——即水的简单扩散学说。然而，该理论不能解释以下生理学现象：如尿的浓缩、P_f/P_d(渗透水渗透性/扩散水渗透性) > 1时水的转运以及有些细胞的水转运可被通道蛋白阻断剂抑制等。因而人们推测细胞膜上存在水分子转运的特殊通道。Agre等首先发现了水通道蛋白AQP1^[23]。Yang^[24]在研究爪蟾卵母细胞表达的UT3(现称为UT-B)时偶然发现并首次证明了UT-B能够通透水。发现UT-B介导的水和尿素的转运几乎不受温度影响，但却能被尿素类似物1,3二甲基硫脲和根皮素显著抑制。随后，Sidoux-Walter等人^[25]研究发现UT-B在正常生理表达水平时不能够转运水。他们采用红细胞Kidd基因编码的人的UT-B，将编码不同剂量的UT-B的cDNA注射到爪蟾卵母细胞，产生不同表达水平的UT-B卵母细胞。研究发现随着UT-B的表达量逐步减少，UT-B透水的性质消失，但尿素的通透性不变。这表明，UT-B透水的前提是在膜上高度表达。

为了进一步证实在生理条件下UT-B能够通透水，2002年，Yang等人^[26]建立了UT-B和AQP1双敲除小鼠，采用停流实验发现双敲除小鼠的红细胞水渗透性比AQP1单敲除小鼠低了4.2倍。此外，定量分析了UT-B对红细胞转运水的贡献比例，在10˚C时，~90%的水通过AQP1转运，~8%的水通过UT-B转运，其他部分通过生物膜单纯扩散的方式。在37˚C时，~79%的水经AQP1转运，~6%的水经UT-B转运，其余部分经生物膜单纯扩散的方式通透。这些结果也说明红细胞UT-B介导的水转运几乎不受温度影响，其原因是UT-B介导的水转运的阿仑尼乌斯能很低，<2 kcal/mol，甚至低于生物膜透水的能量。这些实验证明了UT-B在正常的生理条件可以转运水。

2013年，Slim Azouzi等人^[27]又进一步研究了UT-B介导的水转运，并对其转运机制进行了探究。他们发现在人类红细胞对水的转运过程中，UT-B介导的水转运约占10%，且单个UT-B孔道对水的通透性与单个AQP1孔道的水渗透性相同。Ming Zhou等人^[28]对UT-B的晶体结构做了详尽的解析。他们发现UT-B以三聚体状态结晶。每一个UT-B分子的结构相当于两个半圆柱状结构域相向扣合而成的空心圆柱，这两个半圆柱状结构域结构相似，分别由6段a螺旋构成，并以准2次轴相联系。每一个UT-B分子圆柱状结构的中心孔道是尿素分子通过的选择性滤过通道。这一通道的两端分别称为S_o位点(向细胞外侧开口)和S_i位点(向细胞内侧开口)，孔道的中央称为S_m位点，位于S_o和S_i之间。Slim Azouzi等人发现水分子在S_o和S_i区会形成三个氢键，而在S_m区氢键数量则减少，表明S_m区是水分子通过的主要屏障区。S_m区富含Thr177和Thr339，这两个氨基酸残基是主要的活性位点，该位点与UT-B介导的氨的转运特性也密切相关^[21]。

总之，这些研究表明尿素、尿素类似物、NH₃和水在UT-B中经过同一孔道转运。但是，在UT-B转运过程中这些物质之间是否会通过相互竞争来影响其他物质的转运以及UT-B是否还参与其他物质的转运等有待研究。

基金项目

国家自然科学基金(No. 30870921, 81170632, 81261160507)、科技部国际科技合作与交流专项(No. 2012DFA11070)、教育部高等学校博士学科点专项科研基金(No. 20100001110047)。

NOTES

^*通讯作者。